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(無題) 削除/引用 No.12310-19 - 2024/05/16 (木) 11:57:32 - q 皆さん、ご連絡ありがとうございます。 In-fusion反応を15分から30分に延長すること、UV照射をなるべく避けること、テンプレートの伸長や、ポリメラーゼと配列の相性など、様々なご意見いただきました。どれもとても勉強になりました。 それぞれ1つずつ慎重に検証していきたいと思います。 taqが3´末端にAを付加するということについても、もしかしたら、と思いましたがどうやらIn-fusionには特に影響なさそうですね。 とにかく、皆さんのお力添えで実験が進みそうです。本当にありがとうございました。また何かありましたらよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.12310-18 - 2024/05/16 (木) 07:53:55 - QOD 5'側に余分なもの（相補的でないもの）が付いたらそりゃ駄目でしょう。でも、そもそもPCRで5'側にAが付加されることもないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12310-17 - 2024/05/15 (水) 11:05:36 - おお >[Re:16] 774Rさんは書きました : > 3'突出の制限酵素末端でもInFusionは使えるのにAが１つ付くと効率が落ちるなんて奇妙な話ですね。 おそらく因果関係を探った訳でなく、TAQの特性が原因と言う視点からの一つの思いついた可能性では無いかと。

(無題) 削除/引用 No.12310-16 - 2024/05/15 (水) 10:58:38 - 774R 3'突出の制限酵素末端でもInFusionは使えるのにAが１つ付くと効率が落ちるなんて奇妙な話ですね。

(無題) 削除/引用 No.12310-15 - 2024/05/15 (水) 09:53:55 - おお >[Re:14] おおさんは書きました : > >[Re:13] ぽーさんは書きました : > > 以前、TAKARAの技術部門の人に聞いた時には、incert側のPCR産物の５’部分にAが付加されると、効率が落ちることが多いといわれていました。 > > 最新の情報では更新されていたら混乱を招いて申し訳ありません。 > > なるほど。実際扱っている人の感触として効率が悪くなるという話があったのですね。それなら納得です。 > > なら平滑末端処理してから使えば効率上がるかな、とふと思った。

(無題) 削除/引用 No.12310-14 - 2024/05/15 (水) 09:00:39 - おお >[Re:13] ぽーさんは書きました : > 以前、TAKARAの技術部門の人に聞いた時には、incert側のPCR産物の５’部分にAが付加されると、効率が落ちることが多いといわれていました。 > 最新の情報では更新されていたら混乱を招いて申し訳ありません。 なるほど。実際扱っている人の感触として効率が悪くなるという話があったのですね。それなら納得です。

(無題) 削除/引用 No.12310-13 - 2024/05/15 (水) 08:44:03 - ぽー 以前、TAKARAの技術部門の人に聞いた時には、incert側のPCR産物の５’部分にAが付加されると、効率が落ちることが多いといわれていました。 最新の情報では更新されていたら混乱を招いて申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.12310-12 - 2024/05/15 (水) 08:02:38 - QOD ゲルから切り出したインサートとベクターは一部を泳動して期待通りのサイズ、期待通りの量があることを確認していますか。 また、コンピテントセルの効率は保存状態によっては下がってしまうことがあるので、今回のようなトラブルに直面したときは念のため自分で確認した方が良いと思います。もちろんラボの他の方が問題なく使えているならその限りではありませんが。

(無題) 削除/引用 No.12310-11 - 2024/05/15 (水) 01:31:03 - おお >[Re:8] qさんは書きました : > おおさん > > ゲル切り出しの際はUVを極力避けるために、ゲルの写真を撮影するときだけ照射し、あとは写真を基にバンドの位置を定規を使って計算しながら切り出しています。 私は極力当てないようにしてます。アルミホイルを引いてレーンの端っこだけUVに露出するようにして場所を特定して切り出してます。ま、それでもアガロース内で散乱してホイルの上でもうっすら光っている部分もありますが。 > > スメアについては、局所的な読み飛ばしが蓄積したヘテロ集団というところで、妙に納得してしまいました。プラスミドの消費期限だったり、そもそもの質が悪いことが原因で読み飛ばしが起きてしまったりするのでしょうか。 あくまでの可能性の一つです。構造などの原因でポリメラーゼの伸長速度が落ちたり、似た配列が繰り返しになっていたりするようなところではSlippageなど起こりやすいとは言われてます。また、たまたま一部ノンスペの配列を含んだキメラのようなものが合成されると、本来の配列とアニールしても一部２本鎖になれませんから移動度が構造に依存しやすくなりスメアになってもおかしくないでしょう。テンプレートのクオリティーによる影響ももしかしたらあるのかもしれません。ニックが入っていればそこから進めないわけですけど、その止まったところがなにか似た配列にアニールしたならそこからまた伸長が起こることは想像できますから。 >ポリメラーゼに関しては、他の配列の増幅ではきれいにバンドが出るようなので、問題ないのかなと思いました。 上記のように配列依存的な問題でもありますので、一概にポリメラーゼが悪いとまで言いません。ただ配列に対してポリメラーゼに相性がありそうだというのは漠然と感じているところではないかとおもいます、ある酵素ではきれいにPCRがかかるけど他の酵素ではノンスペがでるとかかからないとかで、それも配列によっては逆転することもあり得るような経験に基づけば。 そういうわけで酵素を変えてみるのが有効かもしれないと思っています。

(無題) 削除/引用 No.12310-10 - 2024/05/15 (水) 01:11:55 - おお >[Re:9] 774Rさんは書きました : > TaqのA-tailingでInFusioが上手くいかないという話は本当ですか？ > 原理からして、3'-5' exonuclease活性でどうせAは削られますよね？ > そうですよね。理論上何ら影響はないですよね。 ちょっとつられて逆の鎖にAがつくことをイメージしてしまいましたが、そうではなくAなどがつく鎖は削られて環状になるのりしろを露出させる部分だし。

(無題) 削除/引用 No.12310-9 - 2024/05/14 (火) 20:36:28 - 774R TaqのA-tailingでInFusioが上手くいかないという話は本当ですか？ 原理からして、3'-5' exonuclease活性でどうせAは削られますよね？ 以下リンクのFig2参照 https://sharebiology.com/infusion-cloning/#infusion-cloning-reaction

(無題) 削除/引用 No.12310-8 - 2024/05/14 (火) 20:11:11 - q おおさん ご連絡ありがとうございます。 私が使用しているコンピテントセルは、takara社のjm109です。 本品の説明書には 「＞ 1×10＾8 colonies/μg・pBR322 プラスミド DNA の効率を得ました。」 とあるので、恐らく大丈夫だと思います。 ゲル切り出しの際はUVを極力避けるために、ゲルの写真を撮影するときだけ照射し、あとは写真を基にバンドの位置を定規を使って計算しながら切り出しています。 スメアについては、局所的な読み飛ばしが蓄積したヘテロ集団というところで、妙に納得してしまいました。プラスミドの消費期限だったり、そもそもの質が悪いことが原因で読み飛ばしが起きてしまったりするのでしょうか。ポリメラーゼに関しては、他の配列の増幅ではきれいにバンドが出るようなので、問題ないのかなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.12310-7 - 2024/05/14 (火) 19:53:45 - q ぽーさん すみません、文字化けのところは「マイクロリットル」と記載しています。

(無題) 削除/引用 No.12310-6 - 2024/05/14 (火) 19:47:10 - q ぽーさん ご連絡ありがとうございます。 ポリメラーゼについて、ベクターはTOYOBO社のKOD oneを、インサートはtakara社のtaqを使用しています。taqを使用している理由は、校正機能を持たないからです。インサートをep PCRで増幅して、ランダムな変異を導入するのが本研究の目的です。 Aが付加されてしまうということを知り、本当に目から鱗でした。やはり、3´末端にAが付加されているとクローニングはできないものでしょうか。それとも、50℃を30分に延長すれば何とかなるものなのでしょうか。ベクターのプライマーを再設計して、5´末端側にTを付けた方が良いのでしょうか。 インサートとベクターの比というのは添加量という意味でしょうか。今回の実験では、それぞれ50 ngと25 ngになるように、5 µLと0.55 µLを添加しました。 (本当は100 ngと50 ngにしたかったのですが酵素を節約するため1/2の系に) 色々書いてしまいまい恐縮ですが、お力をお貸しいただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12310-5 - 2024/05/14 (火) 16:04:33 - おお コンピテントのCfu 活性はどの程度ですか？少なくとも7乗のオーダーは欲しいところ。バックグラウンドが出ないのはまずそこが疑われる。 ゲル切り出しの時は極力UV照射を避けてますでしょうか？ PCRについては多少のスメアは目的のものが増えていれば、切り出しをすればいいですが、貴方の見たバンドが目的のものであるかは我々にはわかりません。スメアになるなら局所的な読み飛ばしなどが蓄積したヘテロの集団かも知れませんし。私はPCRがイマイチだなと思う時は酵素を変えてみます。

(無題) 削除/引用 No.12310-4 - 2024/05/14 (火) 14:33:58 - ぽー PCRの酵素はどのようなものを使われているでしょうか？ Taq系だとAが出てしまいうまくいきません。 経験的に、incertとベクターの比が極端に片方によっている場合はコロニーが出ないことが多いです。 また、５０℃の反応も３０分くらいに時間を延ばしたほうが効率がいいように感じています。

(無題) 削除/引用 No.12310-3 - 2024/05/14 (火) 13:02:30 - q ご連絡ありがとうございます。 1/4でも生えてくるんですね、初めて知りました。経験者の方のアドバイス非常に有難いです。 他に気になる点としては、ベクターが若干スメア気味だったことです。ただ、目的配列部分をゲル切りしているので、大半は目的配列であると思います。だとすると、少しくらいはコロニーができるのではないかと思うので、今回の失敗の原因にはならないかもしれませんが。 他にも、些細なことで大丈夫なのでお気づきの点ありましたらお願いします。

(無題) 削除/引用 No.12310-2 - 2024/05/14 (火) 12:38:44 - 774R 反応液量を半分にしたことは全く問題ありません。 当方、1/4量でも大量のコロニーが得られています。 そもそもそんな反応液を増やしてもコンピテントセルに加えられる液量が限られるので、ここはケチるところです。 ベクター側がPCR産物であることも原理的に全く問題ありません。 どこか別の問題です。

In-Fusion Cloning 削除/引用 No.12310-1 - 2024/05/14 (火) 12:11:45 - q いつも拝見させていただいています。 In-Fusion Cloningを用いてJM109を形質転換しましたが、コロニーが1つも形成されませんでした。実験の流れとしては、インサートとベクターをそれぞれＰＣＲにて増幅し、それを電気泳動、ゲル抽出した後に、In-Fusionしています。 気になっている点としては2つ。1つが、In-Fusionの反応液を半分にしたことです。ゲル抽したインサートの濃度が低かったため、インサートの添加量が多くなってしまいました。そのため、In-Fusion酵素の添加量を2倍にする必要がありましたが、酵素は非常に高価でもったいないので、反応系を2分の1にすることで対応しました。 2つ目に、ベクターは制限酵素処理したものを用いるとあったのですが、PCRで増幅したものを用いているという点です。In-Fusionの原理を確認した上で、PCR産物同士のクローニングでも反応可能だと考えていましたが、これが上手くいかない理由なのでしょうか。 特に2番目は気になっている点です。どなたか、同様の経験または解決策などご存じでしたらご教授お願いします。

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