BioTechnicalフォーラム [脂肪細胞からのタンパク質抽出濃度が薄い]

脂肪細胞からのタンパク質抽出濃度が薄い

No.12319-TOPIC - 2024/05/17 (金) 08:05:04 - あｃ

SVF (脂肪細胞＋α)を抽出して6well plateに撒き、分化後にタンパク質を抽出しているのですが、いつも濃度が薄すぎて困っています。

1）EBT buffer 50ul (いつも濃度が薄いのでかなり少量にしています)
2) Cell scraper
3) ボルテックス30秒
4) 回転させて攪拌60分 (不要かもしれませんが念のためにやっています）
5) 遠心15分
6) 上澄みを回収
7) 濃度計測

WBをするための必要最低量の1/4しかタンパクが取れません。
どこを改良すると良いのでしょうか？ご教授いただけませんか？
　

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No.12319-8 - 2024/05/18 (土) 05:06:05 - あｃ

ありがとうございます！　試してみます

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No.12319-7 - 2024/05/18 (土) 04:44:48 - おお

>[Re:6] あｃさんは書きました :
> なるほど、バッファーの問題とは考えていませんでした。
> 組成に問題はないかなぁと思っていたこと、ラボで10年以上使われていること、組織からのタンパク抽出では全く問題が出ていいないことからです。
>
> なお組成は、以下の通りです。
> Tris-Hcl
> Mannitol
> NaCl
> NaF
> EDTA
> EGTA
> NaPPi Decahydrate
> B-Glycerophosphate
> Glycerol
> Protein inhibitor
>
>

デタージェントがないとLysisが不完全な可能性がありますね。NP-40かTriton X-100を１％ぐらいいれるか、それにさらにDeoxycholateを１％加えればかなり蛋白が抽出されると思います。

WBだけが目的なら１％ぐらいのSDSでもいいでしょう。それの方法は確か誰かが書いてくださっていたと思います。

(無題)

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No.12319-6 - 2024/05/18 (土) 04:32:53 - あｃ

なるほど、バッファーの問題とは考えていませんでした。
組成に問題はないかなぁと思っていたこと、ラボで10年以上使われていること、組織からのタンパク抽出では全く問題が出ていいないことからです。

なお組成は、以下の通りです。
Tris-Hcl
Mannitol
NaCl
NaF
EDTA
EGTA
NaPPi Decahydrate
B-Glycerophosphate
Glycerol
Protein inhibitor

(無題)

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No.12319-5 - 2024/05/17 (金) 19:24:48 - い

EBT bufferを使うことになった経緯, 理由を知りたいです。　低張bufferなのでホモジナイズとか物理的な力加えれば浸透圧ショックで細胞はある程度壊れるかもしれないけど、それで可溶化してくるのは細胞質の可溶性タンパク質に限定されるだろうし、また抽出効率もさほど高くないと思う。

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No.12319-4 - 2024/05/17 (金) 14:22:37 - おお

EBT bufferってこれ？

EBT buffer (10 mM Tris-HCl, 0.05% Tween-20, pH 8.0)
https://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/6/pdb.rec12234.full?text_only=true

ならちゃんと蛋白が抽出されてないと思います。
場合によっては上記のようなバッファーも使わなくもないけど、一般的なLysis Bufferじゃない。

通常１３５から１５０mMの塩化ナトリウムが入っていて（ほぼ生理的な濃度だけど塩がある程度あることで蛋白が遊離してくる）、膜を可溶化する界面活性剤がはいっている。Tween-20は膜を可溶化する能力はほぼない（ちょっとだけ穴を開けるとかはありそうだけど）。

Wikiでも代表的なものはのっているよ。
https://en.wikipedia.org/wiki/Lysis_buffer

Commonly used buffersの

NP-40 lysis buffer
RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) lysis buffer
SDS (sodium dodecyl sulfate) lysis buffer

それともなにか事情があってそのバッファーを使っているのかしら。

(無題)

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No.12319-3 - 2024/05/17 (金) 13:18:15 - い

例えば一つの方法として、

1. wellの細胞をPBSで２回洗う。＊剥がれやすい細胞の場合、できるだけ静かに行うなど慎重に。
2. PBSを１〜１.５ml加えて、テフロン製のセルスクレイパーで細胞を静かに剥がし、懸濁させる。
3. 細胞懸濁液を1.5mlチューブに移す。
4. 遠心（1000~2000xg, 5分、４℃）する。＊沈殿しにくい時は予備実験で遠心条件の検討が必要。
5. 上清を除去。
6. SDS-sample buffer（BPBなし、還元剤なし） (100-150μl)を加えて細胞を溶解する。
　　　＊タンパク質の回収量に応じて液量は適宜調整する。
7. 細い針つきのシリンジで粘性が無くなるまで数回出し入れしてDNAを剪断する。
8. BCA法でタンパク質濃度を測定。（ブラッドホールド法は不可）
9. 還元剤とBPBを添加し97℃、10分間、加熱。
10. 電気泳動へ。

(無題)

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No.12319-2 - 2024/05/17 (金) 10:02:55 - あの

その細胞を使ったことはありませんが、そのままWBしてみたらどうですか？

細胞内に脂肪が多いのでしょう。

それから、あまりに脂肪細胞が太りすぎると　丸っぽくなって、最後はウェル底から剥がれることもあり得るので、ご注意を。

脂肪細胞からのタンパク質抽出濃度が薄い

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No.12319-1 - 2024/05/17 (金) 08:05:04 - あｃ

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