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(無題) 削除/引用 No.12321-7 - 2024/05/19 (日) 13:36:14 - infusion そんなあなたにinfusion cloningがおすすめ

(無題) 削除/引用 No.12321-6 - 2024/05/18 (土) 21:10:40 - ゲンバ つい最近もコロニーは出たけどLigationできてない Ligation試薬でしたってことあるらしいから 試薬を未開封のものか検証用に別の試薬準備してみたら

(無題) 削除/引用 No.12321-5 - 2024/05/18 (土) 21:07:37 - G25 最近も言及したんだけど、 プライマーに付加した制限酵素サイトでPCR産物の末端を切るのは、効率が高くないので慎重に。 十分切断されているか確認して、進めたほうがいいです。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=10784 全然設計どおりに反応が進んでなくて、アクシデンタルに非正規なライゲーションが起こったものだけが生えたんのではないかと思います。 設計どおりの正規の反応が十分な効率でできていれば解決するはなしかも

(無題) 削除/引用 No.12321-4 - 2024/05/18 (土) 20:53:51 - G25 >制限酵素サイトを通常通り付加してPCR（15サイクル）を行い、それを2つの制限酵素で切断し精製しました（PCR産物） その手順だと、制限酵素切断末端が ポリメラーゼで平滑化されかねないんだけど、 実際は制限酵素消化の前にも精製しているのかしら

(無題) 削除/引用 No.12321-3 - 2024/05/18 (土) 18:45:34 - おかしい・・ おお先生 お世話になっております。 > 確かにStbl3の方がいいでしょう。繰返しの配列があるような場合それでつまずく事もあるので。 ありがとうございます。そういっていただけて、やる気が出てきました。

(無題) 削除/引用 No.12321-2 - 2024/05/18 (土) 18:13:41 - おお >[Re:1] おかしい・・さんは書きました : > ご意見いただけましたら飛び上がるほど嬉しいです（泣） > > ネガコンがゼロなので、ligationは確実にうまくいっているはずなのに、 いや、おそらくあまり上手く行ってないか、コンピの効率に問題があるかだと思います。ふつうネガコンで10個ぐらいコロニーが出てもいいようなもんです。その場合ライゲーションがきっちりワークするなら100個以上コロニーが出来る事が大抵です。 なぜこのようなことが起こるのかさっぱりで、二度繰り返しても同じ結果でした。 > > 大腸菌は自作したXL10Goldですが、Stbl3 確かにStbl3の方がいいでしょう。繰返しの配列があるような場合それでつまずく事もあるので。

おかしなクローニング 削除/引用 No.12321-1 - 2024/05/18 (土) 17:34:32 - おかしい・・ ご意見いただけましたら飛び上がるほど嬉しいです（泣） 現在、pcDNA3.1+にクローニングされた遺伝子を、別のプラスミドの２つあるinverted terminal repeat (ITR)の間にクローニングするため、制限酵素サイトを通常通り付加してPCR（15サイクル）を行い、それを2つの制限酵素で切断し精製しました（PCR産物）。それを同じ２つの制限酵素で処理したITR含有プラスミドにHi-T4 ligaseを用いてligationしました。 ネガコンとしては、2つの制限酵素で切断したプラスミドのみにHi-T4 ligaseを加えました。 ポジコンというか、実際のサンプルには、2つの制限酵素で切断したプラスミドと同様の制限酵素で処理した混合物にHi-T4 ligaseを加えました。 結果、ネガコンはゼロ、ポジコンは10-20個の大腸菌が生えました。 ところが昔からの癖でポジコンのコロニーを10つ拾ってコロニーPCRしたところバンドが全く出ず、10つをミニプレップし、上記制限酵素でカットしたところ、１つのみが目的のサイズのインサートを持っていました。 ９つ全ては当初のカラベクターでした。 しかし、その１つの当たりをplasmid全シークエンスしたところ、ITR付近でannotateされない領域がありました。実際、そのプラスミドを293Tに過剰発現させても、目的のタンパク質が発現していませんでした。 ネガコンがゼロなので、ligationは確実にうまくいっているはずなのに、なぜこのようなことが起こるのかさっぱりで、二度繰り返しても同じ結果でした。 大腸菌は自作したXL10Goldですが、Stbl3などの方がいいでしょうか？ ご意見を聞かせていただけましたら大変幸甚に思います。

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