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(無題) 削除/引用 No.12322-34 - 2024/05/22 (水) 11:56:44 - おお やっと電気泳動にたどり着けたようですが、うまくいけばいいんですが。

(無題) 削除/引用 No.12322-33 - 2024/05/22 (水) 09:48:11 - は BCA反応溶液180 μl とサンプル20μlを混合してassayした時、もし測定値が高すぎる（サンプルの蛋白質濃度が高すぎるとか、含まれる可溶化溶液の成分が assayを妨害する恐れがあるなどの）場合、例えば元のサンプルを10倍希釈してそれを20μl取ってBCA反応溶液180μlと混和してassayしたりすると思います。この場合、測定値からは（希釈したサンプルの）蛋白質濃度が算出されます。assayに使用したサンプルは10倍希釈していたわけですから、算出された蛋白質濃度を10倍した値が、元々のサンプルの蛋白質濃度になります。(もし希釈なしでassayしたならば1倍です。)BCA反応溶液180 μl とサンプル20μlの比率は単にこのBCA反応の都合で決められた比率であって濃度計算には関係ありません。測定される蛋白質濃度はあくまでも20μlのサンプル（or検量線のBSA溶液)自体の蛋白質濃度です。 文面から察して基本的な蛋白質関連実験にまだあまり慣れておられないような気がしました。実際に見ればその場で解決するようなことでも、文章のやり取りではなかなか難しく時間ばかり過ぎてしまいますので、学内全体で見たら習熟されている人はたくさんいると思うので、実際に見学なり指導なりを協力してもらう方がずっと容易と思います。最近は大手試薬メーカーなどでもビギナー対象で生化学や分子生物学の各種実験方法について講義と実習がセットになった1~2日のハンズオントレーニングコースを（有償ですが）不定期で開催していますからそうしたものに参加するのも良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.12322-32 - 2024/05/22 (水) 08:28:35 - み >[Re:31] montさんは書きました : > 10倍希釈したサンプル20マイクロリットルを濃度測定に使ったのでしたら、元のサンプルの濃度は、検量線から得られた10倍希釈サンプルの値の10倍である。で、正しいと思うのですが。 > たぶん違いますよ。サンプル20+BCA solution 180の時点で10倍希釈になっていると主張していますから。。。サンプル20は原液かと。

(無題) 削除/引用 No.12322-31 - 2024/05/22 (水) 07:23:57 - mont 10倍希釈したサンプル20マイクロリットルを濃度測定に使ったのでしたら、元のサンプルの濃度は、検量線から得られた10倍希釈サンプルの値の10倍である。で、正しいと思うのですが。 他の方も指摘していますが、lysis bufferの量が少なすぎ。10cmディッシュをPBSで洗い、しつこくPBSを吸引除去したとしても、表面が濡れた状態を保つには50マイクロリットル以上のPBSが残っていると考えます。単純に考えても、50マイクロリットルのLysis bufferを加えても倍以上に希釈されてしまい、塩やデタージェントの濃度が至適濃度にならないだろう、、、と考えます。濃度を上げたいからLysis bufferの量を減らせば良いとは限らず、減らすにも限度があるでしょう。あるいは、Lysis bufferが希釈されることを想定して高濃度に調整する、という手も有りかもしれませんが、量が少ないとロスの割合が増すのであまり良い手ではないですね。

(無題) 削除/引用 No.12322-29 - 2024/05/21 (火) 09:34:44 - おお >[Re:23] signalさんは書きました : > おおさん > > コメントありがとうございます。 > > BCA反応液180μlとサンプル20μl加えてからインキュベートし、測定しています。 > この場合、サンプルは10倍希釈となっているので、計算時には実験で得られた濃度の10倍がサンプル濃度だと考えているのですが、ここが間違えなのでしょうか。 BSAも１０倍になっているはずですよね。だからBSAも十倍にするか、もっと単純に１０倍せずにそのままの値でいいはずです。ただ具体的にどうしたかはわかりませんので、、、 で結局修了は0.4mgということになりますか？ それならあり得る数値と思えます。

(無題) 削除/引用 No.12322-28 - 2024/05/21 (火) 09:31:25 - E >[Re:25] signalさんは書きました : > BSAで0〜2000μg/mlまで検量線を引いています。 その検量線を引くためのスタンダードサンプルも、BCA反応液180μlとスタンダードサンプル20μl加えてからインキュベートしています？それでしたら10倍しなくていいと思いますが。 そのプロテインアッセイはキットを使っていますか？それでしたらよくその説明書を読んで下さい。今一度確認しましょう。 > 教えてくださる先輩はいません。 > 先生も放任気味なので困っています。 かわいそうに。がんばって。

(無題) 削除/引用 No.12322-27 - 2024/05/21 (火) 09:28:02 - signal 検量線は10倍せずに引いています。ということは、当たり前にサンプルも10倍しなくて良いのですね。 本当に注意不足でした。。。 となると、6cm dishから400μgくらいのタンパク質が抽出できた計算になります。

(無題) 削除/引用 No.12322-26 - 2024/05/21 (火) 09:25:24 - T >BCA反応液180μlとサンプル20μl スタンダードはどうやってますか？180ulと各濃度のスタンダード溶液20ulじゃないの？サンプルと同量を入れてるのではないですか？ そこを考えれば、10倍する必要があるかどうかわかると思う。

(無題) 削除/引用 No.12322-25 - 2024/05/21 (火) 09:16:00 - signal BSAで0〜2000μg/mlまで検量線を引いています。 検量線から求めたサンプルの濃度を10倍した濃度が真のサンプル濃度だと思っていたのですが、10倍する必要はないのでしょうか。 教えてくださる先輩はいません。 先生も放任気味なので困っています。

(無題) 削除/引用 No.12322-24 - 2024/05/21 (火) 09:06:21 - E 検量線は？引いていますか？そちらに誰か教えてくれる先輩いませんかね？

(無題) 削除/引用 No.12322-23 - 2024/05/21 (火) 07:52:19 - signal おおさん コメントありがとうございます。 BCA反応液180μlとサンプル20μl加えてからインキュベートし、測定しています。 この場合、サンプルは10倍希釈となっているので、計算時には実験で得られた濃度の10倍がサンプル濃度だと考えているのですが、ここが間違えなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12322-22 - 2024/05/21 (火) 01:06:41 - おお 4mgはあり得ないわ。10の6乗オーダーなら数百マイクログラムといったところだと思う。濃度で1mg/ml前後。 たんぱく定量にも問題がありそうだ。

(無題) 削除/引用 No.12322-21 - 2024/05/20 (月) 23:54:32 - signal みなさま、たくさんのご意見を本当にありがとうございます。 本日、皆さまからのアドバイスをもとに6cm dish(1×10^6cell)を300μlのRIPAでリシスし、シリンジを通してみました。BCA法で定量したところ、4mgのタンパク質が取れていました。 明日、WBを行ってみます。 たくさんのご意見を本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12322-19 - 2024/05/20 (月) 09:05:54 - おお 実験の細かいところは掲示板ではわからないことも多いです。培養ができる環境なら、培養をしている人がすでに昔からいるものだと思われますし、WBも道具が揃っているならラボですでに昔からやっている人がいてもおかしくないと思いますが、そうであるならそういう人に細胞を見てもらったり、相談しながら進めたほうが速いと思います。 あなたの研究室にそういう人がいまいないと言うなら、近所の研究室とかの人とか探してみるのも手です。

(無題) 削除/引用 No.12322-18 - 2024/05/20 (月) 08:51:17 - み >[Re:13] signalさんは書きました : > 私は、HHUAという子宮上皮細胞を使用しています。6cm　dishコンフルエントですと2×10^5cellくらいです。 > 6cm dishコンフルエントなら3x10^6　はあるでしょうね。 細胞数が少なくかつ、buffer volumeも少ないということだと思います。 35mm dishでも1x10^6くらいいると仮定して150-200ulで抽出するのが普通かと。

(無題) 削除/引用 No.12322-17 - 2024/05/20 (月) 08:11:33 - おお >[Re:15] おおさんは書きました : > > https://link.springer.com/article/10.1186/s12935-020-01657-2 > > Cell transfection > shRNAs for LINC00665 were constructed by Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). 1 × 106 cells per well were grown into six-well plates overnight and infected with the vector. The efficacy of transfection was tested using PCR. HMGA1 siRNA (RiboBio, Guangzhou, China). Lipofectamine 3000 (Invitrogen, CA, USA) was utilized to do cell transfection. > ちなみにリポフェくたミンのマニュアルには８０％コンフルで導入すると書かれていてそれが一応スタンダードなプロトコールだと思います。なので１０の６乗という数（1 × 106 cells per wellの部分文字化けてますが）は６Wellでコンフル直前くらいのポピュレーションとも言えるでしょう。 と言うことは６cm Dishでは３から５x１０の６乗個の細胞が取れるものと思えます。

(無題) 削除/引用 No.12322-16 - 2024/05/20 (月) 07:07:05 - おお >[Re:14] signalさんは書きました : > 使用しているRIPAバッファーの組成です。 > > 40 mM Tris-HCl (pH 7.4) > 300 mM NaCl > 0.2% SDS > 2% Nonidet P-40 > 1% Deoxycholic acid > 4mM EDTA > 1／50Protease Inhibitor Cocktail リファレンスある？

(無題) 削除/引用 No.12322-15 - 2024/05/20 (月) 07:05:06 - おお https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0015028203007763 To study the production of IL-6, IL-11, LIF, IL-8, GRO-α, MCP-1, and MIP-3α by ESC and HHUA, 5 × 106 cells were plated on six-well culture plates (Corning) in culture medium with 10% heat-inactivated FBS and cultured until they were fully confluent. https://link.springer.com/article/10.1186/s12935-020-01657-2 Cell transfection shRNAs for LINC00665 were constructed by Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). 1 × 106 cells per well were grown into six-well plates overnight and infected with the vector. The efficacy of transfection was tested using PCR. HMGA1 siRNA (RiboBio, Guangzhou, China). Lipofectamine 3000 (Invitrogen, CA, USA) was utilized to do cell transfection. >6cm　dishコンフルエントですと2×10^5cellくらいです。 HHUAを使った論文をピックアップしました。6well プレートに10の6乗個のオーダーでまいてます。最初に示した論文はちょっと多すぎる気がしますのでオーダー1桁間違ってるかもという気がします。それでもあなたの数字より遥かに大きい。 タンパクの収量が少ないのは細胞数が適切でないからではないですか？あるいはカウントする時計算間違ってるのかな。

(無題) 削除/引用 No.12322-14 - 2024/05/19 (日) 20:00:01 - signal 使用しているRIPAバッファーの組成です。 40 mM Tris-HCl (pH 7.4) 300 mM NaCl 0.2% SDS 2% Nonidet P-40 1% Deoxycholic acid 4mM EDTA 1／50Protease Inhibitor Cocktail

(無題) 削除/引用 No.12322-13 - 2024/05/19 (日) 19:53:55 - signal 皆さまありがとうございます。 そして、詳細をお伝えせず大変申し訳ございません。 私は、HHUAという子宮上皮細胞を使用しています。6cm　dishコンフルエントですと2×10^5cellくらいです。 皆さまがおっしゃっている「粘性」をあまり感じられていません。 RIPAバッファーを入れると、細胞が剝がれてきて白い塊が溶液中に多く集まってきます。これをもっと懸濁すべきだったのでしょうか。 これまでは、白い塊があるままでRIPAバッファーを回収し、溶液が均等に濁るまでボルテックスしていました。

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