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クラミドモナスに抗生物質が効きづらい トピック削除
No.12325-TOPIC - 2024/05/21 (火) 10:18:06 - かず
はじめまして
微生物初心者で初めてクラミドモナスを扱った実験を行ったのですが、選択培地でつまずいてしまいました。ご教授をお願いできませんでしょうか。

クラミドモナス(C. reinhardtii WT137c)にプラスミドを導入する実験を行おうとしています。ゼオシン含有培地で選抜を考えており、前準備で遺伝子導入をしていない細胞で培養を行ってみました。
文献やマニュアルには1.5%寒天 5~10μg/ml ゼオシンとあったので、それらにしたがって、1.5%寒天 10μg/ml ゼオシンを作成して培養したところ播いた細胞数に対して、1/1000程度のコロニーが5日目ごろに出てきてしまいました。(播いたのは15万細胞で150ぐらいのコロニー)
ゼオシンを含有しない培地だと2日目ごろからコロニーがシャーレ全体に広がっていたので、たしかにゼオシンは効いていると思うのですが、文献のゼオシン濃度でこれだけのコロニーが出てきてしまう原因は何が考えられるでしょうか?
よろしくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.12325-19 - 2024/05/30 (木) 17:40:00 - かず
egeriaさん

クラミドモナスは液体培地で植え継ぎを行っていました。
これからは系統維持用に低温・弱光で寒天培地を使った培養を別にしていこうと思います。

凍結もしていなかったので、今回のシングルクローンを拾ったもので、適正な濃度でゼオシンが作用すれば、それをストックしてみます。

知らないことだらけの中、丁寧に教えてくださり、本当にありがとうございました。おおさん、774さんもありがとうございます。

また、結果が出たときに報告をさせていただきます。

(無題) 削除/引用
No.12325-18 - 2024/05/29 (水) 22:29:49 - egeria
そうでしたか。的外れな提案となってしまってすみませんでした。

シングルクローンを拾い直すという話ですが、もしクラミドモナス株の維持を液体培地での植え継ぎで行われているのであれば、効果があるかもしれません。一般的には寒天培地上のシングルコロニーの植え継ぎで維持していることが多いと思うのですが。

すでにされていたら申し訳ありませんが、系統維持用の低温・弱光インキュベーターを別に用意するのがおすすめです。
https://eprints.lib.hokudai.ac.jp/dspace/bitstream/2115/39085/1/67-004.pdf
こちらの解説には試験管と書かれていますが、普通のシャーレでも多めに培地を注いでパラフィルムを巻けば3ヶ月くらいは維持できます。

クラミドモナスに限った話ではありませんが、継代中に性質の変化(変異)が生じるので、できるだけ世代を重ねないように系統を維持する必要があります。本来は凍結保存するのが一番良いのですが、クラミドモナスは凍結が難しく、半世紀以上実験室で継代が続けられてきました。最近は凍結保存法が確立されてきているので、ディープフリーザーで保存しているラボが多いと思います。
https://www.nibb.ac.jp/photo/_src/694/080327NIES-WS.pdf?v=1554191289857
もし凍結保存しているストックがあるなら、それを起こすのは試す価値があります。

これ以上はクラミドモナスの経験のある人に実際に見てもらわないと難しい気がします。もしラボ内に詳しい人がいなければ、株をもらった元のグループなどに相談できればよいのですが。うまくいくことをお祈りしています。

(無題) 削除/引用
No.12325-17 - 2024/05/29 (水) 09:35:00 - かず
egeriaさん

ご回答ありがとうございます。
返信が遅れて申し訳ありません。

光強度120 μmol/m2sと50 μmol/m2sで、培養を行ってみました。
50 μmol/m2sの光強度だと確認できるコロニーの数や大きさが若干減少しましたが、顕著な違いは確認できず、どちらの条件でも5日ほどの培養でコロニーが出現しました。光条件が主な要因ではないかもしれません。

15 μg/mL程度のゼオシン濃度だと、同じ条件でもコロニーの数にばらつきがでました。(10〜数100ぐらい)
50 μg/mLまで濃度を上げると、安定してコロニーの出現はなくなりました。

細胞の問題があるのかなと思っているのですが、
おおさんがコメントしてくださった、シングルクローンを拾い直すことは、クラミドモナスの場合でもすることがありますでしょうか?

よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用
No.12325-16 - 2024/05/23 (木) 22:33:55 - egeria
試薬の管理や培地の作り方、培養温度に問題はなさそうです。

確証はありませんが、私なら生育光によってゼオシンがダメになってしまっている可能性を検討してみます。光強度120 umol m-2 s-1は結構強いですね。独立栄養条件ならそれぐらいあったほうが良さそうですが、TAPならもっと低くても大丈夫です。

すでにご存知かもしれませんが、ゼオシン耐性遺伝子をもつpChlamy4ベクターという製品があります。これの説明書では50 umol m-2 s-1程度の光環境での培養を指示しており、私が扱っていたときもそのくらいだった気がします。
https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0009793_GeneArt_Chlamydomonas_Exp_Vector_UG.pdf

もし光強度を変えることができるなら、光を弱めて試してみてはいかがでしょうか。変えるのが難しければ、とりあえずペーパータオルでプレートをくるむことでも弱めることができます(どの程度弱まるかは光量子計で検討が必要です)。

(無題) 削除/引用
No.12325-15 - 2024/05/23 (木) 09:42:15 - かず
egeriaさん

40 μg/mLでも5日目ごろから見え始めてしまいます。
それより下の濃度ではもっと早くに出てくるので、増殖を阻害している感じはあるのですが、結構な数が出てきます。

培養の画像が以下のものになります。

3日目 d.kuku.lu/rnarrkdrr 
4日目 d.kuku.lu/72357uhv3
6日目 d.kuku.lu/8me57gzwt

プレーティングがまだ未熟な時で、細胞が端によってしまっていて、申し訳ないです。何も書いていないシャーレにはゼオシンが入っていません。

この時は150万細胞ほどまいており、プレーティング後は、温度25℃ 光照射120 μmol/m2sで培養しています。今は細胞数を1/10程度に減らしていますが、他の条件は同様にしています。

ゼオシンはコスモ・バイオ社を使用しています。
購入したのは1カ月ほど前で、すぐに分注して冷凍保存しました。使用するときに解凍して使っています。再度冷凍はしないようにしています。

また、オートクレーブしたTAP培地(寒天含む)の温度が60℃-70℃に下がったところに解凍したゼオシンを入れています。そのあとは、10 cmシャーレに20 mLずつ分注して、寒天培地を作製しています。他にゼオシンを扱っている人はおらず、クラミドモナス用に今回購入しました。

何かお気づきの点がございましたら、ご教授ください。
よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用
No.12325-11 - 2024/05/22 (水) 20:19:47 - egeria
5-15 ug/mLと書こうとしたところ、文字化けしてしまいました。失礼しました。

(無題) 削除/引用
No.12325-10 - 2024/05/22 (水) 20:18:37 - egeria
40 ug/mLでも生えてくるんですか? さすがにそれはおかしい気がしますね。野生株は5–15 ug/mLあたりのどこかで生えてこなくなると思うんですが。↓みたいなイメージです。
https://www.nature.com/articles/s41598-020-67756-2/figures/5

ゼオシンが古くて劣化しているとか、オートクレーブ前に加えているとかいうことはありませんか? ラボ内に同じゼオシンを使っている人はいますか?

(無題) 削除/引用
No.12325-9 - 2024/05/22 (水) 14:46:03 - かず
774さん、egeriaさん

ご回答ありがとうございます。
文献通りにいかないこともある可能性もあることを考慮してもう一度実験してみます。

ゼオシンの濃度については、5〜40 μg/mLまで段階的に変えてみたことがあり、効き目は強まっていったのですが、その時はこんなに入れる時点でなにか間違っていると思い、それ以上のゼオシン濃度の条件検討はやめていました。

感覚的には100 μg/mLまでの濃度でいけそうな感じであったので、まずはゼオシン濃度の条件を探りなおしてみます。

(無題) 削除/引用
No.12325-7 - 2024/05/21 (火) 21:23:22 - egeria
クラミドモナスを数年間扱っていました。

あくまで私の主観ですが、ゼオシンでの選択は微妙なところがあって、ラボによって効き目が変わる印象があります。ゼオシンは光に感受性があるそうなので、培養時に照射する光の強度などが関係するのではないかと想像しています(strainやゼオシンのメーカーなどの違いかも?)。

ですので、文献通りにやってうまく効かなくても、まあそういうこともあるかなという感じがします。自分の実験条件でちゃんとワークする濃度を検討するのがよいと思います。試薬や寒天培地を暗所で保管するのも重要かもしれません。

実験条件自体は特に問題ないと思います。TAP+1.5%寒天は標準的ですし、137cもポピュラーな株ですから、そんなに変なことは起きないでしょう。

(無題) 削除/引用
No.12325-6 - 2024/05/21 (火) 14:22:52 - 774
私もクラミドモナスを扱った経験はありませんが、大腸菌で使用した際はlow salt LBでなければ効かなかった覚えがあります。試薬の説明書を読んでなかったためしばらくハマりました。pHにも影響を受けるとの記載もありますので、いろいろ試してダメだったら文献を疑うことも必要かなと思います。クラミドモナスの培地で塩濃度・pHを調整できるのかわかりませんが。

(無題) 削除/引用
No.12325-5 - 2024/05/21 (火) 14:19:03 - かず
重ねての回答ありがとうございます。

なるほど、いつの間にかゼオシン耐性がある細胞に偏っている可能性があるのですね。
クラミドナモス培養で、シングルクローンを拾いなおすことがされているかや、耐性のないものを拾ってくる方法などは分からないので、クラミドモナスを扱ったことのある方をお待ちしております!

(無題) 削除/引用
No.12325-4 - 2024/05/21 (火) 12:25:37 - おお
クラミドモナスについてはよくわかりませんけど、細胞株とかは研究室ごとの培養の仕方の微妙な違いで若干(場合によっては大きな)フェノタイプの違いが現れることがあります。

クラミドモナスはシングルクローンを拾い直すとかしないのでしょうか。知らない間にヘテロな集団になっている可能性を考えてそういうことをする話がありますので。もし単純に若干ゼオシン濃度を上げても解決しないようでしたらそういうやり方もあるのかなと。

じっさいにクラミドモナスを使っている方のコメントが付けばいいですね。

(無題) 削除/引用
No.12325-3 - 2024/05/21 (火) 12:02:01 - かず
回答ありがとうございます。

塩濃度が感受性に影響を与えることは思い至りませんでした。
ただ今回の場合は、市販のTAP培地に寒天と抗生物質だけの組み合わせなので、塩濃度について文献との違いは出ないように思いました。

(無題) 削除/引用
No.12325-2 - 2024/05/21 (火) 11:31:39 - おお
塩濃度が感受性に影響与えるっていう話がなかったでしたっけ。

クラミドモナスに抗生物質が効きづらい 削除/引用
No.12325-1 - 2024/05/21 (火) 10:18:06 - かず
はじめまして
微生物初心者で初めてクラミドモナスを扱った実験を行ったのですが、選択培地でつまずいてしまいました。ご教授をお願いできませんでしょうか。

クラミドモナス(C. reinhardtii WT137c)にプラスミドを導入する実験を行おうとしています。ゼオシン含有培地で選抜を考えており、前準備で遺伝子導入をしていない細胞で培養を行ってみました。
文献やマニュアルには1.5%寒天 5~10μg/ml ゼオシンとあったので、それらにしたがって、1.5%寒天 10μg/ml ゼオシンを作成して培養したところ播いた細胞数に対して、1/1000程度のコロニーが5日目ごろに出てきてしまいました。(播いたのは15万細胞で150ぐらいのコロニー)
ゼオシンを含有しない培地だと2日目ごろからコロニーがシャーレ全体に広がっていたので、たしかにゼオシンは効いていると思うのですが、文献のゼオシン濃度でこれだけのコロニーが出てきてしまう原因は何が考えられるでしょうか?
よろしくお願いいたします。

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