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(無題) 削除/引用 No.12425-13 - 2024/07/11 (木) 02:18:38 - おお >P１、P2のあとにエタ沈をしたりして粗精製などをしてからカラムにのせるとより良いという話も聞きますね。 ん、P2はアルカリSDSだったっけ。ならその次まで行ってからエタ沈ですね。

(無題) 削除/引用 No.12425-12 - 2024/07/10 (水) 05:40:06 - おお >[Re:11] NODさんは書きました : > 2xYTですと言っといてなんですが、 > > 多分LBでプロトコール通りにやるのが、ゲノムの断片とか、沈殿の分離、DNAの純度とか、一番良いんじゃないかと心の中ではちょっと思ってます。キアゲンの開発した人はいろいろ試してあるんじゃないでしょうか 純度は確かにそうかもしれませんね。一番気になるのはLPSとかですけど。一応除ける事になっているけどCarry overがあれば問題になりますから。NODさんは使われていてそこはあまり気にならないようであればそうでもないのかもしれません。場合によってはP１、P2のあとにエタ沈をしたりして粗精製などをしてからカラムにのせるとより良いという話も聞きますね。 > > 添付文書から少し変えたくなってしまうのは研究職の悪い癖ですが、最近臨床検査技師の人と一緒に働くことがあって、プロトコール厳守で働いている様に心が打たれたのでした かれらの場合はプロトコールに手を加えると結果を左右する可能性があるから、実際に左右されなくてもそういう可能性で使えないし、またより良くなったとしても前のヤリカタのデーターと比較で問題になるし。まあそこまで厳密でなくてもと思うことでもそれでブレると（ぶれないだろうと思っていても）問題にもなるし、ある意味大変な仕事ではありますね。

(無題) 削除/引用 No.12425-11 - 2024/07/09 (火) 16:58:39 - NOD 2xYTですと言っといてなんですが、 多分LBでプロトコール通りにやるのが、ゲノムの断片とか、沈殿の分離、DNAの純度とか、一番良いんじゃないかと心の中ではちょっと思ってます。キアゲンの開発した人はいろいろ試してあるんじゃないでしょうか 添付文書から少し変えたくなってしまうのは研究職の悪い癖ですが、最近臨床検査技師の人と一緒に働くことがあって、プロトコール厳守で働いている様に心が打たれたのでした

(無題) 削除/引用 No.12425-10 - 2024/07/06 (土) 09:38:28 - おお 皆さんありがとうございました。２xYTがポピュラーのようですね。栄養リッチな培地では同じ菌体量でも収量がLBほどでもないといった情報もどこかで見たような気もしたので（それに近い指摘も頂いてますし）、プラクティカルにはどんなもんかと思った次第です。 TFは更にリッチな培地ですから、No.12425-3で指摘していただいたような問題は菌体の量も相当多くなっているためかもしれません。どろっとした状態なら更に酢酸カリウム溶液（Sol III）を加えると落ち着く場合もあるようです。 TBだと抜けることがあるって聞きますね。。。一度だけそういうことを経験したと思いますが、TBだからだったのか定かではありません。

(無題) 削除/引用 No.12425-9 - 2024/07/05 (金) 02:13:42 - たこ 何も考えずにLBの時と同じvolumeでやりましたが、単純に菌体量が多すぎて溶解不全が問題になりました。 MidiですがLBの半量にvolume減らしてやってますが、それ以降問題なく取れています。 TBだと抜ける落ちることがあるとか聞きますけどそんなことも今の所なく。

(無題) 削除/引用 No.12425-8 - 2024/07/04 (木) 18:11:45 - 一兵卒 それは菌量が多すぎて粘性が高くなるため、P3が十分に混合されていないせいだと思います。2xTYでそれが起こらないのは、単に菌量がTBより少ないからではないでしょうか。 > アルカリP2 bufferをいれてドロッとした卵白状にさせたあと、P3をいれても白い塊にならないことはないですか。半透明のドロッとしたまま。

(無題) 削除/引用 No.12425-7 - 2024/07/04 (木) 16:24:57 - あ スレ主さんは、培養液量を減らしたいか、フラスコを小さくしたいんだと思いますが、2xYTだと集菌したペレットがLBより相当大きいのでペレットの重さで培養液を減らせばいいと思います。 比率厳密にすると、プラスミドが落ちて育った分歩留まり悪くなるかもしれないですけど、私は気にしてません、というか、２ｘYTで３００ｍL培養して、カラムに目いっぱい結合させてプラスミド回収してます。代わりに純度が下がってるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12425-6 - 2024/07/04 (木) 14:23:13 - toto それはないですけどねえ。まあ、でもＴＢでなくても、他の、最近出てる安いリッチ培地でもたいしてかわらないくらいとれます。特にTBにこだわって使ってる訳ではないです。

(無題) 削除/引用 No.12425-5 - 2024/07/04 (木) 13:30:40 - あ アルカリP2 bufferをいれてドロッとした卵白状にさせたあと、P3をいれても白い塊にならないことはないですか。半透明のドロッとしたまま。 terrific brothだとですけど。そうなるときとならないときがあって、しくじると１日無駄にするので、２YTにしてます

(無題) 削除/引用 No.12425-4 - 2024/07/04 (木) 13:10:48 - toto もやもやですか？培地は菌体を溶かす前に除くので、わからないですが。SDS-K が不溶性だから、ということですかね。

(無題) 削除/引用 No.12425-3 - 2024/07/04 (木) 11:22:44 - あ 2xYTを使っていますが、Terrific Brothだとアルカリリシスの中和後沈殿しないでモヤモヤのままになったりしませんか？ リン酸バッファーのせいと聞いたことがあるのですが。

(無題) 削除/引用 No.12425-2 - 2024/07/04 (木) 10:56:02 - toto ずっとそれやってます。

maxiprep using TF broth 削除/引用 No.12425-1 - 2024/07/04 (木) 05:40:21 - おお maxiprepのばあいLBで３００mlぐらいの培養だったと思いますが、例えばTerrific Brothなど栄養素Richな培地で１００mlぐらいで培養してmaxiprepのきっとを使うとかやっている人、やっとことある人いませんか？

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