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(無題) 削除/引用 No.1243-2 - 2012/12/12 (水) 19:54:29 - KY 一般論ですが、 定量PCRは一サンプル当たり１００−２００円と割高です。なのでアニーリング温度やMg濃度、PCR酵素の条件検討だけでもそれなりなコストがかかってしまいます。かといってこれらのパラメーターはあまり劇的な改善が個人的にはありません。 プライマーを変更することが一番劇的に改善しますし、人的コストも少なくてすむし、インターナルコントロールと同じ条件である方が、PCRサンプルの調整ミス等の心配もなくなります。なので、プライマーを変更することが第一選択だと思っております。

組織由来cDNAの定量PCR 削除/引用 No.1243-1 - 2012/12/12 (水) 15:15:00 - OCT 前任者がOCTコンパウンド包埋した組織をクリオスタットで切り出し、 RNA抽出、random hexamerで合成したcDNAを用いて、 現在定量PCRをおこなっています。 目的の遺伝子を発現する培養細胞のcDNAを用いた定量PCRの系で ワークしていたプライマーを組織由来cDNAにも用いたのですが、 融解曲線解析において非特異的な増幅を示すブロードな波形を示し、 定量することが出来ませんでした。プライマーの箇所を (標的遺伝子の5'側から3’側に）変更すると、 組織由来cDNAでも融解曲線解析においてきれいな波形を示し 定量することが可能となりました。 こういう現象が起きるのは、RNAの断片化・分解が原因かと思いますが、 cDNAの再作製が出来ない場合には、プライマーを複数設計しトライするしか ないのでしょうか。 ご経験者がいらっしゃいましたら、アドバイス等頂けたら幸いです。

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