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(無題) 削除/引用 No.12440-13 - 2024/07/12 (金) 21:57:12 - さと すみません、別のパソコンから一時的にアクセスしていたので、「さと」＝「みる」、です。

(無題) 削除/引用 No.12440-12 - 2024/07/12 (金) 21:50:24 - さと 皆様 多くのご意見ありがとうございます。 確かにマーカーによるずれも考えられるのですが、あまりにもズレているもので、、 おおさんのおっしゃる通り、KDやKOで使っている事、複数のグループが使っている方が信頼できると思います。 今回、多くのBRD4抗体のデータシートで200以上に出ていたので、こちらが正しいのかと考えておりました。 ちなみに、Ripa bufferで細胞を溶解しタンパク質サンプルを作り、JESSという全自動WBの機械を使用しているのですが、こちらでもクロマチンとの結合は外れると考えて良いものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12440-11 - 2024/07/12 (金) 18:15:24 - おお >[Re:10] とさんは書きました : > 修飾の可能性は考えられますね。 > データシートで使用されているサンプルや細胞が入手できるようなら評価してみてはいかがでしょうか？ > 他社の抗体のデータシートを確認してみても良いかもしれません。 > > > ご質問から話は逸れますが、私は論文やデータシートは参考にはしますが、特に論文はあまり信用しません。 > 抗xx抗体を使ってsingle bandで検出したので大丈夫、論文で使われていたから大丈夫と考える人も少なからずいると思っているからです。 まあ、100%信用できないんだけど、KDやKOで使っている事、複数のグループが使っている事などを指標に絞り込めばいくらか確率は上がる。 > ある蛋白で複数の市販抗体が正しいバンドを検出できないことを経験しています。 まあまあそう言うことありますよね。 > >

(無題) 削除/引用 No.12440-10 - 2024/07/12 (金) 17:15:29 - と 修飾の可能性は考えられますね。 データシートで使用されているサンプルや細胞が入手できるようなら評価してみてはいかがでしょうか？ 他社の抗体のデータシートを確認してみても良いかもしれません。 ご質問から話は逸れますが、私は論文やデータシートは参考にはしますが、特に論文はあまり信用しません。 抗xx抗体を使ってsingle bandで検出したので大丈夫、論文で使われていたから大丈夫と考える人も少なからずいると思っているからです。 ある蛋白で複数の市販抗体が正しいバンドを検出できないことを経験しています。 （実験条件やWB条件の影響もあるとは思いますが） 怪しいと感じた時は、細胞でKDして、複数の抗体を用いてバンド特定し、最も反応性が高く特異性の高い抗体を選択するようにしていました。

(無題) 削除/引用 No.12440-9 - 2024/07/12 (金) 15:46:09 - おお SDSPAGEのバッファー系などによっても、移動度に違いが出ることがあります。バンドのサイズのずれを気にするよりはKDやKOなどでバンドが弱くなっている事が示されている論文となどを見たりして、それに使われている抗体を考えるとかするといいと思います。場合によってはカタログにそう言ったバリデーションのデーターが載っている商品もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12440-8 - 2024/07/12 (金) 13:52:33 - 774R バンドが大きくシフトしてるのは特定の抗体だけの話ではなく、複数の会社の抗体でそのようになってますし、論文データでも200kDa付近に出ていますので、これはBRD4の性質だと思います。

(無題) 削除/引用 No.12440-7 - 2024/07/12 (金) 13:40:53 - アセチル 774Rさん そうでしたか。ご返答ありがとうございました。 みるさん 私はデータシートのバンドサイズが予想サイズよりもあまりにも大きくずれている場合はその抗体の購入を躊躇してしまいます。実際にWBすると予想サイズどおりとのことなので、hjklさんがおっしゃっているようにデータシートのマーカーがずれているのかもしれませんね。同じメーカーの他の抗体も同じようなずれ方をしているのだろうか？と思いました。同じマーカーを使っているならずれ方も同じになりそうですよね。

(無題) 削除/引用 No.12440-6 - 2024/07/12 (金) 12:35:28 - 774R >WBでもクロマチンへの結合が維持されているものなのでしょうか？ これは早とちりでした。非共有結合のようですのでSDS-PAGEでは外れます。 他には、ユビキチン化されるという情報もありましたが、これが原因かどうかは分かりません。

使用した有色分子量マーカーの特性とか 削除/引用 No.12440-5 - 2024/07/12 (金) 12:23:38 - hjkl 細胞や実験条件の違いによる翻訳後修飾の差異の影響とかアミノ酸組成の偏りとかいろいろあると思いますが、よく言われていることの一つとして、その時に使用した有色分子量マーカーの違いに起因する場合あります。 分子量マーカーはたとえ同じ分子量ということになっていても、電気泳動してみるとメーカー間で異動度が少しずつ異なることはよくあります。例えば調べてるタンパク質がA社のマーカーだと50KDaのマーカーより上にバンドが来るけど、B社のマーカーだと50KDaのマーカーよりも明らかに下とか。また同一メーカーの同一型番であってもロットによって異動度が少し異なることもたまにあるそうです。 以前に二つのメーカーに聞いたこともありますが、（特に有色の）マーカーについては正確な分子量を保証するものではなく基本的にあくまでおおよその目安と考えてください、と言われました。

(無題) 削除/引用 No.12440-4 - 2024/07/12 (金) 10:17:55 - アセチル >アセチル化されたクロマチンと結合することが知られています。 WBでもクロマチンへの結合が維持されているものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12440-3 - 2024/07/12 (金) 10:04:49 - みる 早々にありがとうございます。 だから分子量が大きな位置にバンドがでるのですね。

(無題) 削除/引用 No.12440-2 - 2024/07/12 (金) 10:01:19 - 774R anti-BRD4のWBの結果の一例。 https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/bet-20130227-1.asp?entry_id=10628 アセチル化されたクロマチンと結合することが知られています。

WBのバンドのずれにつきまして 削除/引用 No.12440-1 - 2024/07/12 (金) 09:58:19 - みる このたびマウス細胞株からタンパクを抽出し、BRD4というタンパク質を確認しています。 予想される分子量はLong variantで153kDaであり、実際に行った実験ではこの位置にバンドが出ているのですが、データシートでは200kDa以上の位置にバンドが存在します。 他の論文を見てみても、150くらいに存在するものもありますが、200kDa以上に存在するものも散見されます。 ここまでずれることはあるのでしょうか？NIHのデータベース等を確認してもやはり150kDaくらいが正しそうです。 ご助言のほど、よろしくお願い申し上げます。

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