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(無題) 削除/引用 No.1266-7 - 2012/12/20 (木) 03:21:39 - おお >[Re:6] Harmoniaさんは書きました : > Cos-7はTを持っている細胞でしたっけ？ もってます

(無題) 削除/引用 No.1266-6 - 2012/12/19 (水) 20:19:47 - Harmonia > ウエスタンでそのPlasmidを細胞（293T&Cos-7)にtransfectionしてもきち > んと検出できる。しかしHela細胞だけどうしても検出できない。 Cos-7はTを持っている細胞でしたっけ？ SV40 oriのベクターなら、293Tで検出できてHeLaで検出できない理由は思い つく。 ちなみに配列確認のプライマーは何ですか？

(無題) 削除/引用 No.1266-5 - 2012/12/19 (水) 10:08:17 - ~ ・ウエスタン きちんと検出できるというのは、ネガティブコントロールやベクターの濃度を変更したサンプルも並べてみているのでしょうか？ 単に内在性のタンパク質の有無を見ているだけということはありませんよね？ ・シークエンシング 何も読めていないようですので、プライマーとプラスミドの組み合わせが違っているのかもしれません。 まずは、制限酵素地図を作製して取り違えがないか確認してはいかがでしょうか。 ウエスタンの結果がきちんとしているのであれば、プロモーター−ORFは生きているのでしょうけれども、入っているベクターが違うのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1266-4 - 2012/12/19 (水) 09:52:52 - おお シグナルが弱すぎて読めないというのは何を持っていっているのでしょうか、蛍光強度の絶対値でみているのでしょうか、それとも波形データーのやまが下の方にあるからそういっているのでしょうか。波形データーのグラフは相対的なので気おつけてください.

(無題) 削除/引用 No.1266-3 - 2012/12/19 (水) 09:49:47 - おお プライマーが間違えているんじゃない? 制限酵素とかでいちおう期待したプラスミドが取れているか目星はつけているよね。プライマー何種類かあるなら、PCRで使えるような組み合わせがあれば、PCRしてバンドが得られるか見てみるとか、、、 簡単にPCRかかるようだったら、そのプライマーでシーケンシングの反応も期待できるでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.1266-2 - 2012/12/19 (水) 09:37:27 - 774 違うプライマーで読んでみる。

シークエンスが読めない。 削除/引用 No.1266-1 - 2012/12/19 (水) 08:31:03 - ぽち どうしても、分からないので教えてください。 10年以上前のPlasmidDNAのシークエンスを読もうとしています。 私が調整したわけではないので詳しくは分かりませんが、 教授が作ったPlasmidでその時には、たぶん配列は確認したとのこと。 ウエスタンでそのPlasmidを細胞（293T&Cos-7)にtransfectionしてもきちんと検出できる。しかしHela細胞だけどうしても検出できない。 DH5αコンピを使いtransformationしても全くシークエンスが読めず、HTSO8のコンピを使って30℃でtransformationしてもシークエンスが読めない。 シークエンスが読めないと言ってもいろいろあると思うんですが 最初10個ほどNが連なり、それ以降はシグナルが弱すぎて検出できない or Nの羅列ばかりで全く読めない。 シグナルが弱すぎて読めないものはPlasmidの量を増やしてもNが連なるばかり。 コンストラクトからやり直した方がいいのでしょうか？ 解決方法があるなら教えていただきたいのです。よろしくお願いします。

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