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(無題) 削除/引用 No.12750-6 - 2024/12/28 (土) 13:43:09 - asan エンドトキシンフリーうたうカラムは、旧来は各社が独自に開発してきたイオン交換によるもので、midi prep以上で原則販売されてるもので、mini prepはシリカカラムによる簡易的な精製なので基本的に除去できるほどの純度がないからだと思います。この辺はコストの問題もあるのでしょうが、最近売られてるmini prepで transfection gradeと言われるものはあくまで除去液によるwash stepを増やしてるもので、おそらくここで言われてたTriton-x114とかその手の界面活性剤によるものでしょう。ただ、これも限界あるだろうから、汎用性の高い細胞株とかなら良くても、繊細なプライマリー細胞株や血球由来の細胞などの感受性が高いものを使う時はよくないかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.12750-5 - 2024/12/27 (金) 15:42:01 - おお みなさんありがとうございます。 エンドトキシンを特に除かないでもできてしまう感受性の低い細胞はたしかにありますね。大昔にキットを使わずにラージプレップしたとされるプラスミドがストックされていて（そのボスはキットを使わないでやってたらしい）、使ってみるとプレップによってはすごく毒性があるとか言うことがあったので、一応気にはしています。また、場合によっては違う細胞を使うこともまあまあありますので、一応除去されていたほうが安心かと思ってます。 改めて探すとトランスフェクションに支障がないレベルで除けているとされるミニプレップキットはありそうなので改めて考え直すことにします。 現状ではTX-114をつかって除いています。

(無題) 削除/引用 No.12750-4 - 2024/12/23 (月) 14:37:35 - う こういうの買えばいいと思うんですけど、 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K210002 こういうので除くってのはどうでしょう。 https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100004338 私、endotoxin-freeではないqiagen miniprep kitでトランスフェクションしたことありますが、結構（というかかなり）細胞に入って発現はしますよ。エンドトキシンによる刺激が入ると困るならやめた方がいいですけど

(無題) 削除/引用 No.12750-3 - 2024/12/23 (月) 13:45:26 - 774R ミニカラムにQiagenとかののEndotoxin removal solutionを組み合わせればできるような気がします。 Triton X-144が同等品だと聞いたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.12750-2 - 2024/12/23 (月) 13:00:35 - takara > 一方、ミニプレップでエンドトキシンフリーのプラスミドをとるというコンセプトのキットはないような気がします。 フリーではないけど、タカラ（マッハライ）で売ってる。 NucleoSpin® Plasmid Transfection-grade https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?catcd=B1000736&subcatcd=B1000742&unitid=U100009234

エンドトキシンフリーミニプレップ 削除/引用 No.12750-1 - 2024/12/22 (日) 14:26:26 - おお 最近ちょっとコンストラクションして哺乳細胞にトランスフェクションするという作業を久々に頻繁にやるようになってきました。 トランスフェクションのプラスミドの量は２４ wellプレートなどつかえば１ug未満で済んだりしますので、ミニプレップで精製したプラスミドで制限酵素やシーケンシングで確認したあの残りで十分実験に使える量のプラスミドが残ってます。 一方、ミニプレップでエンドトキシンフリーのプラスミドをとるというコンセプトのキットはないような気がします。 これは思い込みなのかもしれませんので、なにかそのようなキットとかご存知でしたら教えてくれませんでしょうか？その他なにか思いついたことがあればコメントくだされば幸いです。 こちらはミニプレップはキットを使わず。配列確認の後にキットを使わずエンドトキシンを除きつつ精製度を上げてトランスフェクションに使ってます。

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