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(無題) 削除/引用 No.12754-11 - 2025/01/09 (木) 03:06:33 - おお >[Re:10] kndtさんは書きました : > 10^6、つまり350万cells/tubeです。 了解です。 その細胞独自のコンディションが必要なのかもしれませんね。もしかしてなにか疾患のある人からの細胞なんでしょうか。開示できないかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.12754-10 - 2025/01/08 (水) 09:13:58 - kndt 10^6、つまり350万cells/tubeです。

(無題) 削除/引用 No.12754-9 - 2025/01/08 (水) 09:07:33 - kndt ありがとうございます。 じぶんもそう思っていたのですが、今使用しているヒト線維芽細胞の説明には凍結濃度は3.5x10⁶(cells/tube)と書いてあり、10�pdish1枚ではその半分以下の細胞数しかなかったようなのです。

(無題) 削除/引用 No.12754-8 - 2025/01/08 (水) 04:10:42 - おお あ、失礼しました。凍結時の細胞濃度ということですね。 でも１０cm １Dish分を１mlの保存液に懸濁したら大体適切な濃度になると思いますが、、、きになるなら半分でもいいかと思いますけど。 https://www.atcc.org/products/pcs-201-012 ATCCでうっているNormal Human Fibroblastは Cells per vial ≥ 5.0 x 10＾5、Volume 1.0 mL となっています。 だいたい販売されている細胞は凍結の状態で5.0 x 10＾5から１.0 x 10＾６ ８０％コンフルでそれぐらいの細胞数にはなってませんか？

(無題) 削除/引用 No.12754-7 - 2025/01/07 (火) 15:43:03 - おお >[Re:6] kndtさんは書きました : > ご意見ありがとうございます。ご指摘いただいたように、凍結時の細胞濃度に問題があるかもしれません。がん細胞の時の慣習から、凍結時に細胞数を毎回測ったりしていませんでしたが、思っていたよりもシャーレ一枚あたりの細胞数が少ないときがあり、結果細胞濃度が薄くなり育ちが悪いだけのようです。 > 経験が浅いうえにこうした基礎的なことが聞ける環境でないため、助かっております。 > ご丁寧にありがとうございました。 > いや、80％コンフルで凍結して、それを戻してるんでしょう｡80％コンフルの細胞の数で少ないならいくらまくんですか？80％の細胞数で3割ぐらいしか生きてないと言うのが問題と思いますよ｡

(無題) 削除/引用 No.12754-6 - 2025/01/07 (火) 11:47:16 - kndt ご意見ありがとうございます。ご指摘いただいたように、凍結時の細胞濃度に問題があるかもしれません。がん細胞の時の慣習から、凍結時に細胞数を毎回測ったりしていませんでしたが、思っていたよりもシャーレ一枚あたりの細胞数が少ないときがあり、結果細胞濃度が薄くなり育ちが悪いだけのようです。 経験が浅いうえにこうした基礎的なことが聞ける環境でないため、助かっております。 ご丁寧にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12754-5 - 2024/12/28 (土) 10:54:49 - rtyhu 再培養時に見られる問題の多くは凍結時に原因があります。なので凍結時の工程も具体的に記載した方が、回答者側もより問題箇所を見つけやすいと思います。バンバンカーで細胞を懸濁する際に、細胞の沈殿に残存する培地の量が多いとバンバンカーが希釈されて、十分な保護効果が発揮できないかもしれません。培地はアスピレータ等でできるだけ完全に除去しましょう。またスローフリージングとは具体的にどんなふうに行なっているのでしょうか。プログラムフリーザーを使用してた大昔と違い、例外はあるかもしれませんが、今は直接-80℃に入れても特に生存率で問題起きることは通常はないともいます。うちもずっとバンバンカーですが、株細胞に限らず初代培養や組織幹細胞も含めて、細胞懸濁液をクライオチューブに入れたらすぐに-80℃に入れてそのままですが、再培養で生存率や増殖能が低下して困った経験はありません。 凍結した際の細胞濃度があまりに低いと生存率が低下したり増殖の立ち上がりがすごく遅くなる（特には細胞が途中で死ぬ）ことがあります。バンバンカーに懸濁した細胞の濃度は（常識の範囲で）なるべく高い方がいいです。特に初代培養ではできるだけ分裂回数を無駄に進めないためにも、播種する細胞濃度には留意した方がいいです。私たちは基本的には１枚のdishで細胞が平均１〜２回分裂したら100%コンフレンシーになる（１〜２Population doubling level( PDL)に相当。)ように播種してます。（細胞数をいちいち数えなくてもいいので、たとえばコンフレントに近い１枚のdishの全細胞を同じサイズのdish２〜４枚に分けるみたいに。) あと、気をつけることとして、再培養の際の培地は古くないですか？培地中のグルタミンの半減期はおよそ１ヶ月です。培養細胞の場合、グルタミンは生合成だけではとても追いつきませんので培地からの供給が必須です。エネルギー代謝だけでなく、核酸塩基やグルタチオンの原料にもなるので、グルタミンが不足すると増殖や生存率への影響がしばしば目立ってきます。

(無題) 削除/引用 No.12754-4 - 2024/12/27 (金) 18:39:14 - おお 融解し、まく前にトレパンブルーなどで生細胞の割合の確認はしてますか？

(無題) 削除/引用 No.12754-3 - 2024/12/27 (金) 16:17:07 - あrはえtじゃみゃmr あまりに薄くまくと増えが悪い経験あり。 結構濃いめに継代するのがオヌヌメ

(無題) 削除/引用 No.12754-2 - 2024/12/24 (火) 07:49:48 - おお 特にそんなに特殊なことが必要ではなかったと記憶してますが。

ヒト繊維芽細胞の培養、冷凍保存の方法 削除/引用 No.12754-1 - 2024/12/23 (月) 16:55:23 - kndt いつも大変勉強になっております。ヒト繊維芽細胞を培養経験のある方はいらっしゃいましたら、ご教授いただければ幸いです。 推奨培地、条件で培養し、培養自体は問題なくできております。実験に使用し継代を繰り返し育ちが悪くなったため寿命を迎えたと判断し、初期（3‐4継代）にストックしておいた凍結細胞を解凍し培養を開始しました。しかし、育ちがよくありません。（生きている細胞は3割くらい、死滅した細胞が多くあります。） 凍結していた細胞は、数か月前に推奨細胞数で、バンバンカーを使用しslowfreezingし―80度フリーザーで保存しました。10�p dishにfullになる前の8割くらいで細胞が元気なときに冷凍しています。 解凍時は37度で急速解凍し培地で洗浄してから10�pdishに播種しており通常の解凍方法と特別変えてはいません。細胞シートみても、あまり変わったところはないと思っているのですが、ヒト線維芽細胞特有の注意点等がありますでしょうか。私の研究室ではいままで主にがん細胞を扱っており、他に扱っている方がいません。 アドバイスいただけたら幸いです。

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