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(無題) 削除/引用 No.1286-11 - 2012/12/27 (木) 18:32:49 - CHX >[Re:10] みさんは書きました : > 対象蛋白のturnoverがどれくらいなのか分からない以上、CHXが効いてないとは判断できませんね。 ありがとうございます。とても参考になります。今のところ、そういったことをやった報告はありませんと。 > ４ｈって早いですね。それで変動しなくても不思議には思わないなあ。 > しかし細胞が浮くというのは気になるなあ。 > うちはDMSO溶解ですけどね。 そうですか、そうかもしれませんね。DMSO溶解はトライしています。 > turnoverが早いものならCHX処理した群ではmRNAレベルが上昇することが考えられるけど検討してみたら？ > > アクチノマイシンDで転写も同時に止めるとか。 実は、わたしもアクチノマイシンDを考えていました。積極的にやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1286-10 - 2012/12/27 (木) 13:28:40 - み 対象蛋白のturnoverがどれくらいなのか分からない以上、CHXが効いてないとは判断できませんね。 ４ｈって早いですね。それで変動しなくても不思議には思わないなあ。 しかし細胞が浮くというのは気になるなあ。 うちはDMSO溶解ですけどね。 turnoverが早いものならCHX処理した群ではmRNAレベルが上昇することが考えられるけど検討してみたら？ アクチノマイシンDで転写も同時に止めるとか。

(無題) 削除/引用 No.1286-9 - 2012/12/27 (木) 08:07:36 - CHX >[Re:8] おおさんは書きました : > わたしも293で100 ug/mlでO/N処理しましたが、細胞は平気そうでした。。。濃度というより細胞が変わってしまっているとか、バイチのコンディションが違うとか、、、 おおさん、ありがとうございます。なるほど、、、同じくリボソームに作用するネオマイシンでも私は通常500 ug/mlの濃度で使いますので、そういうことでしたら、何か起きている可能性は高いです。293Tではなく293を使おうかな？　KYさんは省略されたか何かで濃度に言及されていなかったので。多少は検索したのですが。 > いずれにしろ細胞がへたってるとよくないわけで、、、、、実験の発展性を見逃すのもどうかと思います。 実は、ほかの実験で不安定性の誘導はほぼ確実なので、最後の詰めの段階です。ご心配なく。サイエンスですから最後で矛盾するデータが出ることも可能性もわずかではありますが残っています。

(無題) 削除/引用 No.1286-8 - 2012/12/27 (木) 07:23:11 - おお >[Re:7] CHXさんは書きました : > >[Re:6] KYさんは書きました : > > 他の文献をみても293で24時間処理している論文などあるので、293でも浮くほどtoxicにはならないと思います。 > > 浮かないのは、濃度によると思います。100 ug/mlは多少強烈かもしれません。 わたしも293で100 ug/mlでO/N処理しましたが、細胞は平気そうでした。。。濃度というより細胞が変わってしまっているとか、バイチのコンディションが違うとか、、、 いずれにしろ細胞がへたってるとよくないわけで、下げるのは分かるのですがそれで効果がなければ実験にならないわけですから、何かコントロールになるタンパクをパラレルに検出して、既に知られているタンパクで、このような結果で、その条件下であなたの見ているタンパクはどうだったというデーターの作り方をしないと、発表もできないデーターになる可能性もありますよ。 そもそも分解が早いのはあなたの感触で、実験根拠があるかどうか知りませんが、なければ実際はそうじゃないのかもしれませんし、仮にあったとしてもCHXを使って逆の結果が出た場合に、それは単なるネガティブデーターというより、何故そうなるのかという点で実験の発展性を見逃すのもどうかと思います。 実験するなら結論が導き出せるようにしておくべくと思うのですが、いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1286-7 - 2012/12/27 (木) 06:01:56 - CHX >[Re:6] KYさんは書きました : KYさん、ありがとうございます。参考になります。 > 他の文献をみても293で24時間処理している論文などあるので、293でも浮くほどtoxicにはならないと思います。 浮かないのは、濃度によると思います。100 ug/mlは多少強烈かもしれません。言われていることから、浮かない程度に低濃度、長時間を試してみようと思います。すでに始めました。

(無題) 削除/引用 No.1286-6 - 2012/12/27 (木) 01:23:19 - KY > それは100ug/mlで、293Tを使った場合でしょうか？たしかに、作り直すのはいいアイディアと思います。よろしければ、使った溶媒をお教えください。水系の溶媒ではｐHによって不安定のようです。 他の文献をみても293で24時間処理している論文などあるので、293でも浮くほどtoxicにはならないと思います。私の以前のラボでは水に50mg/mlぐらいで溶かして、-20℃保存していたかと思います。何年も使用しておりましたが、chxが使えなくなるようなトラブルはありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1286-5 - 2012/12/27 (木) 00:55:13 - CHX >[Re:3] KYさんは書きました : > うまくいかないとは、どのようにうまくいかないのでしょうか？ > 目的のタンパク質の減少が見えないということでしょうか？ > 存知の不安定なタンパク質の分解は見えているのでしょうか？ 下に書いたようなことです。（わずかな時間差で、お答えに気づきませんでした） > cycloheximide ４時間で細胞が浮いてしまうというのは、やけにtoxicだと思います。他の細胞で、昔行ったときは24時間は張り付いていました。粉が残っていればcycloheximideを作り直してみては。 それは100ug/mlで、293Tを使った場合でしょうか？たしかに、作り直すのはいいアイディアと思います。よろしければ、使った溶媒をお教えください。水系の溶媒ではｐHによって不安定のようです。

(無題) 削除/引用 No.1286-4 - 2012/12/27 (木) 00:47:27 - CHX ＞100 ug/mlで４時間という条件はどうやって決めたんですか？ 自分の試行錯誤をした上、さらに文献にある強めの条件を採用しました。 ＞細胞が浮き始めるのがうまく行かないという意味なのか、コントロールになるような蛋白が減らないのがうまく行かないという意味なのか、”不安定である印象がある蛋白”が減らないのがうまくいかないという意味なのか。。 不安定である印象がある蛋白が減らないという意味です。 私の場合、まったく該当の分野にいませんので、そのようなポジティブコントロールをまだ取っておりません。 細胞が浮き始めるのはとても気持ちが悪いですが、その意味ではなく、それにもかかわらず既述のようにより強い条件を検討する予定です。 参考になりました、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1286-3 - 2012/12/27 (木) 00:36:52 - KY うまくいかないとは、どのようにうまくいかないのでしょうか？ 目的のタンパク質の減少が見えないということでしょうか？ 存知の不安定なタンパク質の分解は見えているのでしょうか？ cycloheximide ４時間で細胞が浮いてしまうというのは、やけにtoxicだと思います。他の細胞で、昔行ったときは24時間は張り付いていました。粉が残っていればcycloheximideを作り直してみては。

(無題) 削除/引用 No.1286-2 - 2012/12/27 (木) 00:18:28 - TK-1 100 ug/mlで４時間という条件はどうやって決めたんですか？ うまく行きませんというのがどういうものなのかも、はっきりしません。細胞が浮き始めるのがうまく行かないという意味なのか、コントロールになるような蛋白が減らないのがうまく行かないという意味なのか、”不安定である印象がある蛋白”が減らないのがうまくいかないという意味なのか。。印象があるというのも何の根拠があるかわかりませんし、もう少しscientificになれませんか？

cycloheximide chase 削除/引用 No.1286-1 - 2012/12/26 (水) 22:28:28 - CHX cycloheximide chaseがうまくいきません。目的蛋白は不安定である印象がある蛋白です。現在、検索中ですが、なにか相乗効果のある薬剤を加えたりする手法はあるでしょうか？　もしくは、なにかコツみたいなものはありますでしょうか？　 転写が抑えられてもとりあえずは構いません。 系は293T、cycloheximide濃度は100ug/ml、４時間まで試しています。この最大条件では細胞が浮き出していますので、気持ちが悪いのですが、これ以上を試す予定です。ウエスタンで検出しています。

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