BioTechnicalフォーラム [Factor Xaってどれほどのもんですか？？？]

Factor Xaってどれほどのもんですか？？？

No.1301-TOPIC - 2013/01/04 (金) 15:32:17 - ECOLI

Factor Xa（GE）でGST融合タンパクを切っても切れ残りがあったり、タンパクの精製量が大幅に減るとラボの某先輩に言われ、ひよってます。

そこで色々調べてみたのですが、PreScission Protease（GE）というものを見つけました。
これも違うベクターで発現させたGST融合タンパク質を切断できる酵素らしいのですが、どなたか使われた方はいらっしゃいますか？

結論を言うと、Factor XaとPreScission Proteaseの使用感を教えていただければ幸いです。

宜しくお願いします。
　

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別にFactorXaに限ったことではないですが

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No.1301-10 - 2013/01/29 (火) 15:38:27 - こうじ

予備的に少量の系で切断条件を決めていますか？
一義的に処理してもうまくいかないことが多いですよ。

例えば酵素：タンパク質容量比で
1:300,1:1000,1:3000,1:10000みたいにふって
処理後SDS-PAGEで確認して処理しないと
望みの箇所以外の切断や切れ残りが多くなります。

(無題)

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No.1301-9 - 2013/01/16 (水) 07:12:19 - qq

Xaの酵素活性には、カルシウムが必須だけど、OKですか？

お礼

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No.1301-8 - 2013/01/15 (火) 22:13:02 - ECOLI

皆様

レスポンスありがとうございました。
とりあえずFactorXaでトライしてみましたが、皆様の仰る通り非常に微妙な結果でした。
PreScission Proteaseで試してみます。

今後ともよろしくお願いします。

(無題)

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No.1301-7 - 2013/01/06 (日) 18:01:29 - enrico

>特異性ってFxaでは非特異な切れかたがあるってことですか?

非特異的というか、Xaは配列にIEGの次にRがある場合に、その後ろを切りますが、プロテアーゼですから、基質の立体構造に依存し、量比にも寄ります。メーカーのprotocolにあるように、切断はあくまでpreferentiallyです。切れないからといって、大量にXaを加えると、思わぬところが切れることがあります。制限酵素のようなわけにはいきません。ただ、Xaの場合は、切れるはずなのに切れないことのほうが多いです。PreScissionも基本的には同じ問題を持ちますが、低温で消化できるので、構造揺らぎで変な場所が切れるということが比較的少ないのかもしれません。

(無題)

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No.1301-6 - 2013/01/06 (日) 14:35:13 - おお

あ、PCRベースのテンプレート作成をしてるんですね。

どなたかPCRベースとプラスミドベースの効率の比較されたかたいないですかね。PCRはどうも混じり物が出てくるきがして気持ち悪い。。。

(無題)

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No.1301-5 - 2013/01/06 (日) 14:31:31 - おお

>[Re:3] enricoさんは書きました :
> PYKさんに同じです。メーカーとは何の係累もありませんが、FactorXaでも確かに切れるのは切れますが、効率が圧倒的に悪く、切れたバンドが見える、という程度です。PreScissionでは特異性も高く、低温でよく切れるので、安心です。いまだにXaを目にするのが不思議です。

特異性ってFxaでは非特異な切れかたがあるってことですか?

PreScission認識配列をもつタンパクにはつかえないですよね。あ、認識配列がFxaより長いか。

HRV 3C Protease

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No.1301-4 - 2013/01/06 (日) 14:10:36 - mon

他社でも同等品が購入できますよ。
http://www.merckmillipore.com/japan/life-science-research/hrv-3c-protease/EMD_BIO-71493/japanese/p_48Wb.s1O2.sAAAEj.Rt9.zLX
http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/product/life/turbo3c/index.htm

(無題)

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No.1301-3 - 2013/01/04 (金) 19:28:35 - enrico

PYKさんに同じです。メーカーとは何の係累もありませんが、FactorXaでも確かに切れるのは切れますが、効率が圧倒的に悪く、切れたバンドが見える、という程度です。PreScissionでは特異性も高く、低温でよく切れるので、安心です。いまだにXaを目にするのが不思議です。

(無題)

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No.1301-2 - 2013/01/04 (金) 18:36:13 - PYK

はじめまして。
両者を比較したことがありますが、PreScissionはほとんど切断できたのに対して、Factor Xaは全くダメだった記憶があります。
私はPreScissionをお薦めします！