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(無題) 削除/引用 No.1303-11 - 2013/01/06 (日) 07:07:45 - おお バイチに直接サンプルバッファーをいれてSDSPAGEではみれませんか?ELISAという手もあるかと。 凍結乾燥はやったことがありませんけど、バイチ成分塩やアミノ酸なども濃縮されますので、、、直接バイチをSDSPAGEで検出できないならIPしてしまう手もあるかもしれません。 透析してから凍結乾燥でもいいかもしれませんけど、、、手間が増えるだけ工夫しないとINPUTの量があわせにくくなります。 マイクロチューブのふたに透析膜があるものがあるのでそれで一定量入れて透析してそのチューブごとスピードバックするならINPUTの量が保てるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1303-10 - 2013/01/06 (日) 00:18:12 - あいう 皆様ありがとうございます。 第一選択として、まず無血清培地上清の westernをやりたいと思います。 培地を冷凍して、凍結乾燥し、 SDS bufferに溶解、で良いのでしょうか？

参考までに 削除/引用 No.1303-9 - 2013/01/05 (土) 10:11:33 - KIO もう１０年以上前の話ですが、ある膜タンパクのmRNA発現をNorthern blot analysisおよびin situ hybridizationで解析した論文を投稿した際、reviewerに”mRNA発現とタンパク発現が必ずしも相関しないのは常識である、タンパク発現も解析するように”と言われ、追加実験したところreviewerのいう通りの結果でした・・・

(無題) 削除/引用 No.1303-8 - 2013/01/05 (土) 04:42:19 - おお すいません。こだしになってしまいましたが、、、 そのタンパクを発現しないようなスプライシングアイソフォームとか、その遺伝子に対して-鎖側から発現しているようなRNAを見ていたりしている可能性はないですか?

(無題) 削除/引用 No.1303-7 - 2013/01/05 (土) 04:39:01 - おお 分泌するような物とかだとERにアクセスしているかどうかと言うのを調べたりしている研究があったような気がします。

(無題) 削除/引用 No.1303-6 - 2013/01/05 (土) 02:31:06 - おお mRNAの翻訳制御については、いろいろと研究があります。miRNA による制御もその一つです。またp-bodyまたストレスstress granulesといったところにはmRNAが豊富ですが翻訳されずにとどまっていると考えられています。 そのmRNAのUTRに注目するとなにか分かるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1303-5 - 2013/01/04 (金) 23:41:44 - まっくろん フローサイトで細胞毎のサイトカイン産生を見る場合は、Brefeldin Aなどで、サイトカインを細胞内に留めて、染色しますよね。たしか、ゴルジ体阻害剤だったと、記憶してますが。「速やかな細胞外放出」を想定されるのであれば、方法としては、ありかもしれません。あとは、培養上清をELISA(WB . IP)でみるとか。 また、WBはタンパク量や抗体濃度なとによりサチレーションすることがある(しやすい)と個人的にはおもうので、(すでにされているかもしれませんが)タンパク量や抗体濃度を振って、結果が変わらないことを確認するのが良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1303-4 - 2013/01/04 (金) 22:10:00 - Harmonia 異なる切り口の実験をいくつか準備するほうがいいと思う。 具体的には知らないけど。 細胞外輸送 細胞外輸送阻害剤ってあるのでしょうか？あるなら、細胞内に閉じ込めて 細胞を回収すればいい。 もちろん、培地から回収する方法も、証拠の一つですが。 分解 転写と同様に翻訳も活性化されてるけど、たんぱく質分解で調節されてい る可能性もある。MG132とか、使える阻害剤があるかも。見たいものによ ってはJNKを動かすこともあるので、話がややこしくなるけど。 翻訳 ポリソーム解析はできるの？ で、これ全部起こっているときはどうする？

(無題) 削除/引用 No.1303-3 - 2013/01/04 (金) 21:53:17 - あいう ご返信ありがとうございます。 後者の仮説(速やかに細胞外に放出)を 立証するには、培地を回収して ウェスタンか免疫沈降すればよいのですよね？ 類似の実験のご経験がある方がいらっしゃれば、 実際をお聞きしたいです。

(無題) 削除/引用 No.1303-2 - 2013/01/04 (金) 21:39:34 - Harmonia 経験はないですが、そういうこともあるでしょうね。 で、「本当にその観察事実は正しいですか？」ってとこを押さえるのは 大切だけど、けっこう大変な実験だったりして。 「うん、なるほど君のその仮説は正しかった！」 と言われるように、スマートな実験を考えてください。

mRNAとタンパクの結果が異なるとき 削除/引用 No.1303-1 - 2013/01/04 (金) 20:27:27 - あいう 現在あるペプチドホルモンのmRNAとタンパクの変化をReal-time PCRとウェスタンで 見ています。コントロール区に対して、実験区ではmRNAの大幅な増加(5サイクルくらい) が認められましたが、ウェスタンで見るとほとんど変化は見られません。 この場合、転写は活性化されているが翻訳については活性化されていない。 あるいは、翻訳されるものの速やかに細胞外に放出されるため、 細胞の抽出物でウェスタンをやると差が見られない。ということが あり得るのかどうか、ご経験談を伺えればと思います。 何卒、お願いいたします。

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