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(無題) 削除/引用 No.1317-15 - 2013/01/09 (水) 09:32:54 - おお >[Re:13] kanazawaさんは書きました : > > そうですね。 > あまり完璧は求めないことにしようと思います。 > > ありがとうございます。 ---- 完璧だと、その分子量にバンドが来る訳ではないとおもいますが、、、

(無題) 削除/引用 No.1317-14 - 2013/01/09 (水) 09:30:47 - kanazawa ＞Harmonia様 とっても失礼であることを承知で可能性を述べますが、 マーカーの読み間違いをしていませんか？ じつは学生のころに経験がありまして。 また、既製品でずれるというところが気になりまして。 マーカーのどのバンドがどのサイズかの確認のために、 レンジの違う２種類のマーカーをつかい、トラブルシュ ートしました、そのときは。 ------------------------------------------------------ ご回答ありがとうございます。 マーカーの読み間違いはないと思います。 私も現在、2種類のマーカー（レインボー、色が付いてないもの） を用いて実験を行っています。

(無題) 削除/引用 No.1317-13 - 2013/01/09 (水) 09:27:36 - kanazawa ＞ぱるる様 おお様もご指摘しておられますが、自分で手を動かした実験は理論通りにぴたっと当てはまることはなかなか無いので、柔軟に考えていくといいと思いますよ。 ご質問に対して明確な答えを出せずに申し訳ないですが。 ------------------------------------------------------------ そうですね。 あまり完璧は求めないことにしようと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1317-12 - 2013/01/09 (水) 09:26:02 - kanazawa ＞おお様 マーカーも会社、エイどう条件でずれます。どこかららそのタンパクを購入しているようですが、そうするとそのタンパク(製品)がおかしいと思っているのでしょうか?それなら会社に問い合わせてみてはどうですか?会社の製品がおかしいと思ってなくても、会社はタンパクを作っているならタンパクの性質には詳しいかもしれません。 先行の研究もその会社から買ってますか? あとはその予想してるサイズはどこから来てるんですか?アミノ酸の配列からの理論値ですか?そんなのエイどうで同じサイズに来ない例はいっぱいあります。 わたしが昔やってたたんぱく質はアミノ酸で900ほどでGFPのタグをつけて 120kDaのところにくるんですが、違うグループはタグなしで115kDaにバンドを示してました。その状態でGFPタグをつけると140ぐらいになるはずですよね。 いまつかっているタンパクもアミノ酸の長さから55kDAあたりと代々の予想をたてれるのだけど、じっさいSDSPAGEでは75kDAあたりにきます。 バンドの位置があなたの実験にクリティカルじゃないならあまり気にしないで良いと思います。 いまSDSPAGEようプレキャストゲルもグラジエンととか以外にもバリエーションが増えてますので(バッファーシステム、ゲル中のSDSの有無など)検出位置にバリエーションが増えても不思議ではないです。そういうところも文献上で調べてみればいいかもしれません。あなたと違うかもしれません。 SDSPAGE自身がわるかどうかは、えいどうが乱れているとか、通常より解像度が悪いとか、マーカーの流れ方が変だとか、いつもと違うとか、そういうのは直接データーを見ないと分からないですし、あなたの研究室で経験のある方に相談してください。 ----------------------------------------------------- ご回答ありがとうございます。 ブタの酵素に関しては先行研究のものと 同じ会社から購入しています。 会社に問い合わせてみるというのは 考えておりませんでした。 検討してみます。 20kDaほど大きな分子量のずれも出てくる時があるんですね。 お聞きして少し安心しました。 もう一度指導教官に相談して 条件を考えてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1317-11 - 2013/01/09 (水) 02:19:05 - おお サイズが計算した分子量と会わないというのはここでも昔からいっぱい議論がありますので、検索かけてみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1317-10 - 2013/01/08 (火) 21:53:49 - Harmonia とっても失礼であることを承知で可能性を述べますが、 マーカーの読み間違いをしていませんか？ じつは学生のころに経験がありまして。 また、既製品でずれるというところが気になりまして。 マーカーのどのバンドがどのサイズかの確認のために、 レンジの違う２種類のマーカーをつかい、トラブルシュ ートしました、そのときは。

(無題) 削除/引用 No.1317-9 - 2013/01/08 (火) 20:36:47 - ぱるる おお様もご指摘しておられますが、自分で手を動かした実験は理論通りにぴたっと当てはまることはなかなか無いので、柔軟に考えていくといいと思いますよ。 ご質問に対して明確な答えを出せずに申し訳ないですが。

(無題) 削除/引用 No.1317-8 - 2013/01/08 (火) 19:16:07 - おお マーカーも会社、エイどう条件でずれます。どこかららそのタンパクを購入しているようですが、そうするとそのタンパク(製品)がおかしいと思っているのでしょうか?それなら会社に問い合わせてみてはどうですか?会社の製品がおかしいと思ってなくても、会社はタンパクを作っているならタンパクの性質には詳しいかもしれません。 先行の研究もその会社から買ってますか? あとはその予想してるサイズはどこから来てるんですか?アミノ酸の配列からの理論値ですか?そんなのエイどうで同じサイズに来ない例はいっぱいあります。 わたしが昔やってたたんぱく質はアミノ酸で900ほどでGFPのタグをつけて120kDaのところにくるんですが、違うグループはタグなしで115kDaにバンドを示してました。その状態でGFPタグをつけると140ぐらいになるはずですよね。 いまつかっているタンパクもアミノ酸の長さから55kDAあたりと代々の予想をたてれるのだけど、じっさいSDSPAGEでは75kDAあたりにきます。 バンドの位置があなたの実験にクリティカルじゃないならあまり気にしないで良いと思います。 いまSDSPAGEようプレキャストゲルもグラジエンととか以外にもバリエーションが増えてますので(バッファーシステム、ゲル中のSDSの有無など)検出位置にバリエーションが増えても不思議ではないです。そういうところも文献上で調べてみればいいかもしれません。あなたと違うかもしれません。 SDSPAGE自身がわるかどうかは、えいどうが乱れているとか、通常より解像度が悪いとか、マーカーの流れ方が変だとか、いつもと違うとか、そういうのは直接データーを見ないと分からないですし、あなたの研究室で経験のある方に相談してください。

(無題) 削除/引用 No.1317-7 - 2013/01/08 (火) 18:45:22 - kanazawa ＞ぱるる様 マーカーの説明書などに何％ゲルで流した図であるかなどは記載なかったでしょうか？ 既製品ならば理論上はその分子量のタンパク質であるはずですが、マーカーは検量線より求められた概算値なので、使用するアクリルアミド濃度や架橋度などでバンドパターンは若干変化しますよ。 ----------------------------------------------------- マーカーの説明書に関しては確認しておりませんでした。 確認してみます。 ですが、 私の実験のように20kDaも差があるのは異常ではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1317-6 - 2013/01/08 (火) 18:37:25 - kanazawa ＞ひかり様 そもそも、厳密に分子量通りに泳動されるとは限らないのではないでしょうか。コマーシャルの同等品はありませんか。気になるのならゲルのアクリルアミドの％を変更してみてはどうでしょう。 --------------------------------------- ご返信感謝致します。 確かに分子量通りに泳動されるとは限りませんが、 私の実験結果で出たように 既知の分子量との差が20kDaもあるのは さすがに異常と感じます。 また、現在私は予備実験としてこれを行っており、 これは先行研究のマネです。 その先行研究の論文では きれいに分子量通りに泳動ができています。 現在私が使っているブタ由来の酵素と その先行研究のブタ由来の酵素と 製造会社まで一緒です。 アクリルアミドの％のお話がありましたが、 5%,7.5%,10%いずれの濃度でも バンドとマーカーの位置関係はさほど変わりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1317-5 - 2013/01/08 (火) 18:31:10 - ぱるる マーカーの説明書などに何％ゲルで流した図であるかなどは記載なかったでしょうか？ 既製品ならば理論上はその分子量のタンパク質であるはずですが、マーカーは検量線より求められた概算値なので、使用するアクリルアミド濃度や架橋度などでバンドパターンは若干変化しますよ。

(無題) 削除/引用 No.1317-4 - 2013/01/08 (火) 18:22:13 - ひかり そもそも、厳密に分子量通りに泳動されるとは限らないのではないでしょうか。コマーシャルの同等品はありませんか。気になるのならゲルのアクリルアミドの％を変更してみてはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1317-3 - 2013/01/08 (火) 18:20:56 - kanazawa >ぱるる様 ご返信感謝致します。 ブタ由来、ウシ由来ともに既製品です。

(無題) 削除/引用 No.1317-2 - 2013/01/08 (火) 17:55:32 - ぱるる この用いているタンパクというものは既製品ですか？ それとも、ご自身で遺伝子をクローニングしたものを培養細胞中で発現したものなのでしょうか？

SDS-PAGEで、サンプルの分子量が予想以上に小さい。 削除/引用 No.1317-1 - 2013/01/08 (火) 17:23:38 - kanazawa 投稿失礼いたします。 現在、卒業研究の中でSDS-PAGEを用いて 実験を行っています。 用いているタンパク質は ブタ腎臓由来のアミン酸化酵素と ウシ血漿由来のアミン酸化酵素です。 これらの酵素の分子量は ブタ由来：87kDa ウシ由来：85kDa ですが、私の実験では 両方とも60kDa後半くらいになってしまっています。 この理由としてどんなことが考えられますか？ また、これを修正するには どんな方法を取ればよいでしょうか？ ご教授よろしくお願いいたします。

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