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(無題) 削除/引用 No.1320-5 - 2013/01/09 (水) 21:33:20 - Yossi おお様、早速のコメントありがとうございます。 > AKT下流に注目するならレシオがどうであれ絶対地で燐酸かが増えていれば、細胞ないの下流のシグナルは促進されているでしょうし(その燐酸かが活性化をいみしていれば)、絶対地はどうであれ、レシオがかわれば細胞内の燐酸か、脱燐酸かの活性のバランスが変わったといえるでしょうし。 　AKTの下流のシグナルとしてpGSK-3βを見ましたが、AKTの活性化と相関するような結果が得られました（AKTはGSK-3βのリン酸化を抑制するはずですが…）。 > Aが癌遺伝子ということなので、そのがん遺伝子が寄与しているがん細胞でAKTの発現が動いてなければ、実験的アーティファクトと考えて見るのもてかもしれません。そういう根拠があるなかで、タグ入りAKTを導入してmRNAれべるで発現変動がないものの燐酸かのステータスをみるのはてかもしれませんけど。 　違う細胞株でAが発現しているものがあるので、それでも検討してみたいと思います。恒常的活性型AKTを導入してみることも考えていましたが、あまり時間的猶予がなく、少し手間がかかりそうだったので保留としていました。少し検討してみます。貴重なご意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1320-4 - 2013/01/09 (水) 21:12:34 - Yossi toyo様、早速のコメントありがとうございます。 　当方で使用している抗体はCST社のpAKT-Ser473（D9E）およびpan-AKT（C67E7）です。pan-Akt抗体はAktのC末部位を抗原としています。 　AおよびMockのpAKTのバンドは10分、15分でピークを認め、30分、60分につれてかなりバンドが薄くなるパターンを示しています（0分ではバンド認めません）。AKTはタイムコースにかかわらず各分で同じように見えています。ですので、逆相関はしていないようです。

(無題) 削除/引用 No.1320-3 - 2013/01/09 (水) 20:00:50 - おお >[Re:1] Yossiさんは書きました : > 　pAKT/AKT比でみると、AはAKTのリン酸化を抑制すると言えるのかとも思われるのですが、本当にそれでよいのかわかりません。ちなみに再現性のある結果でした。 複数のことが起こっていますので、ちょっと解釈が難しいとおもいます。どっちが一次的で、どっちが2次的なのかというてんです。また何が言いたいかによっても、見方が変わると思います。 AKT下流に注目するならレシオがどうであれ絶対地で燐酸かが増えていれば、細胞ないの下流のシグナルは促進されているでしょうし(その燐酸かが活性化をいみしていれば)、絶対地はどうであれ、レシオがかわれば細胞内の燐酸か、脱燐酸かの活性のバランスが変わったといえるでしょうし。 > 　AがAKTの量を増やす、またGAPDHの量を減らすなどとも言えるのでしょうか。 これはそうでしょうね。ただ一つの(種類の)実験だけで結論を出していいかというのはありますが。 Aが癌遺伝子ということなので、そのがん遺伝子が寄与しているがん細胞でAKTの発現が動いてなければ、実験的アーティファクトと考えて見るのもてかもしれません。 そういう根拠があるなかで、タグ入りAKTを導入してmRNAれべるで発現変動がないものの燐酸かのステータスをみるのはてかもしれませんけど。 ちょっと慎重にいろいろ仮設を立てながら探っていった方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1320-2 - 2013/01/09 (水) 19:12:59 - toyo 以前、培養細胞をインスリンなどで刺激して、pAkt(Ser473)とpan-Aktを10分毎のタイムコースで測定したことがあります。 記録が手元にないので少しうろ覚えですが、pAktとpan-Aktのタイムコースが逆相関していたように思います。 Ser473はAktのC末側にかなり近い部分にあると思いますが、そのpan-Akt抗体はAktのC末部位を抗原としていたので、Ser473のリン酸化に伴ってAktを認識しづらくなるのかななどと勝手に想像していました。 質問者さんの場合にもタイムコースを取っておられるようですが、そのあたりはいかがでしょうか？ 少し変なコメントかと思いますので、遺伝子導入の結果の解釈については他の方に回答をお任せしたいと思います。

遺伝子導入でAKTの量が増える？ 削除/引用 No.1320-1 - 2013/01/09 (水) 17:26:03 - Yossi 　実験結果で解釈に困ることがあり、皆様のお知恵を拝借できればと思い投稿させていただきました。 　とある癌遺伝子（Aとする）を血球系細胞（32D-cl3）にレトロで遺伝子導入し、Aの機能解析（AがAKTのリン酸化を抑制するか）を行っています。 　方法としては、Aおよびコントロールベクター（Mock）を導入した32Dを12時間IL-3を非存在下で培養後にG-CSF（100ng/ml）で刺激し、0分、10分、15分、30分、60分後にそれぞれ細胞を回収し、PBSで1回washし、RIPAバッファー（SDS入り）で溶解し、遠沈後の上清を回収し蛋白濃度を測定し、30ug分をSDS-PAGEしています。メンブレンに転写後、pAKTおよびAKTのブロットをしています。 　結果、pAKTはコントロール（Mock）と比べてAで抑制されているのですが、total-AKTを見ると、Mockと比べて10倍程度Aの方が多いのです（Mockの方が結構バンドが薄いです）。 さらにはGAPDHを見ると、逆にMockがAと比べて10倍程度多いのです。ところがβ-Actinを見てみると量はそろっています。 ちなみにIL-3存在下（通常状態）で培養中のAKT、GAPDH、ActinをW.Bで見ると量はそろって見えます。 　pAKT/AKT比でみると、AはAKTのリン酸化を抑制すると言えるのかとも思われるのですが、本当にそれでよいのかわかりません。ちなみに再現性のある結果でした。 　AがAKTの量を増やす、またGAPDHの量を減らすなどとも言えるのでしょうか。 　長文で失礼しますが、何かアドバイスがあればよろしくお願いいたします。

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