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(無題) 削除/引用 No.1332-6 - 2013/01/18 (金) 11:46:08 - う GFPが全く固定によって変化がないと仮定したとしても。 固定した細胞と 生きている細胞 どこまで構造が同じままなのか？ このことを考えただけでも、 結構なことだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1332-5 - 2013/01/15 (火) 12:13:57 - ふぃっくす MeOH固定では蛋白を凝集させるだけで、PFAでも近くにいる蛋白を架橋するだけなわけで、MeOHはもちろんですが、PFAでも、入れた瞬間にそこで架橋して止まるわけではなく、しばらく分子が動いてから架橋が進んで止まることになりますね。細胞質の蛋白濃度からすると、蛋白分子のしめる空間は細胞質空間の1-5％程度と思いますが、だとすると、完全に動かなくなるまで、それなりの時間がかかるでしょう。つまり、PFAを入れた時点の場所の近くにとまるとは思いますが、同じではないはずです。PFAを加えていつ見るかによって、膜の近くに集まったり、塊を作ったりしやすくなるんじゃないですかね。 膜そのものについてはもっとやっかいで、脂質は固定されないので、蛋白が少ないドメインがあると、PFA固定によって膜の形態が変わることもあります。固定、というのはあんまり正確な用語ではないように思います。

(無題) 削除/引用 No.1332-4 - 2013/01/15 (火) 01:25:27 - おお >[Re:3] 固定さんは書きました : > きょう焦点の専門家によると、GFPにおいては固定したほうが、フォトブリーチングが少ないそうです。実際に経験しました。EGFPではありませんけど。 >[Re:2] みさんは書きました : > Livingで観察する場合は分子が常に動いているでしょう。 > > 固定した場合は、固定法によって細胞、細胞内小器官、分子の構造が変化するでしょう。固定すると培養皿やスライドガラスに扁平に貼り付いた状態になりますよね？ > > たとえばPFA固定とMeOH固定では見え方が全然違ってくるでしょう。 > > 電顕でグルタルアルデヒド含有のPFAなどを使用するのはなるべく生きている時の微細な位置関係を保持するためじゃないでしょうか。 固定さん、みさんありがとうございました。 確かに構造が変化すると印象として変わってくるかもですね。 動いているのは確かにそうかもしれません。興味深いですさらに具体的な話があれば聞いてみたいです。 なるほど。。。固定してみる時はフォトブリーチング防止用試薬を加えると思いますから、それがどれほどGFPに効果的かよく分かりませんけど抗酸化剤の類と思いますけど、ある程度は効いているのかもしれませんね。 固定といってもどこもかしこも全く同じように固定されているわけでもないかもしれませんので感受性が局所で変わるかもしれませんね。 んでもいまのところ見る限り退色していって見え方が変わっていっているような感じじゃないなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.1332-3 - 2013/01/14 (月) 19:25:14 - 固定 きょう焦点の専門家によると、GFPにおいては固定したほうが、フォトブリーチングが少ないそうです。実際に経験しました。EGFPではありませんけど。

(無題) 削除/引用 No.1332-2 - 2013/01/14 (月) 12:15:31 - み Livingで観察する場合は分子が常に動いているでしょう。 固定した場合は、固定法によって細胞、細胞内小器官、分子の構造が変化するでしょう。固定すると培養皿やスライドガラスに扁平に貼り付いた状態になりますよね？ たとえばPFA固定とMeOH固定では見え方が全然違ってくるでしょう。 電顕でグルタルアルデヒド含有のPFAなどを使用するのはなるべく生きている時の微細な位置関係を保持するためじゃないでしょうか。

EGFP固定前後 削除/引用 No.1332-1 - 2013/01/13 (日) 13:30:55 - おお 免疫染色で興味深いとピがたってましたので便乗して。 EGFPタグをつけたたんぱく質を培養細胞で発現させていますが、固定せずに見ているのと、PFAで固定後見ているのでは少し見え方にが違うように見えてます。たしかに固定後でシグナルが弱くなるのは一般論で聞いていますし、そう感じますけど。 今のところこれによって解釈が変わるとかそういうことはないのですけど、何かそう言うことでご存じのことがありましたらお教えください。

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