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(無題) 削除/引用 No.1334-11 - 2013/01/16 (水) 06:15:51 - おお あ、FLAGの部分は切っているから関係ないですね。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.1334-10 - 2013/01/16 (水) 06:14:32 - おお 解決の糸口がつかめてよかったです。 フィードバックもきけて、有用な情報になりました。 引き続き、溶出に関して有用な情報が得られるといいですね。 たしかシグマにFLAG M2に相性が悪いデタージェントとかのリストがありましたので、外すときはそう言うのを使う手もあるかもしれません。 http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.Par.0001.File.tmp/a2220bul.pdf

(無題) 削除/引用 No.1334-9 - 2013/01/16 (水) 05:12:10 - テップ 実験してみました。 TEV elution bufferに入れていたMgClを抜いてEDTA入れたら、ちゃんと目的バンドが見えました。 でもビーズのフラクションのみで、Elutionのフラクションにはほぼ０でした。ビーズのフラクションだから切れていないものがでるはずなのに、なぜかほとんど切れた位置にバンドが見えました。。。 合成時もMgClを入りで、なにもプロテアーゼ阻害剤を入れていないのに、そのときは分解を受けません。FLAG-M2で精製するとライセート内では抑制されていたMg依存的なプロテアーゼのコンタミによって分解されてしまうということですかね。。。 とりあえず、次は溶出できるようになんとかしないと。

(無題) 削除/引用 No.1334-8 - 2013/01/15 (火) 00:03:30 - テップ >[Re:7] おおさんは書きました : > > なぜ合成時に安定で、精製してから壊れるのかというと、一つのスペキュレーションとして、プロテアーゼがたのたんぱく質などで活性がマスクされているとか、精製後はターゲットだけ濃縮されてしまっているなどスペキュレーションが成り立たなくもないです。 確かにそれなら説明ができますね。目的タンパク質にプロテアーゼがくっついているのかもですね。 >[Re:6] 非特異的分解さんは書きました : > Factor Xaで似た経験がよくあります。目的蛋白が、５−１０分の１くらいに減りました。非目的部分との比率は１：１になるはずなのですが。非特異的分解か？　よって、量によっては見えなくなることはあると思います。 やはり分解が一番説明できそうですね。とりあえずプロテアーゼインヒビターを入れてTEV 溶出してみようと思います。 その後の実験目的のためにと思って溶出バッファーにMgCl入れているのも良くないかもですね。EDTAちゃんと入れてみます。

(無題) 削除/引用 No.1334-7 - 2013/01/14 (月) 23:40:03 - おお これ、もしかしたらそのタンパクの分解系の糸口にはならないかなぁと思ったりもしますよ。まあよくあることという発言もあるので、実験的なアーティファクトの可能性もぬぐえませんけど。 IP後の洗いのコンディションを少し厳しくできないでしょうかね。そうすると何らかの理由でくっついてきているプロテアーゼがあるなら、除ける可能性も高いかと。 あと合成後にいろいろと不可逆的に働くプロテアーゼいんひびたーを加えてIP後洗いで取り除けばいいかもしれません。 まあ、質問者さまがプロテアーゼが原因と思えるかどうかというのもありますでしょうし、ほかの意見もあるかもしれませんから、判断はおまかせしますけど。 なぜ合成時に安定で、精製してから壊れるのかというと、一つのスペキュレーションとして、プロテアーゼがたのたんぱく質などで活性がマスクされているとか、精製後はターゲットだけ濃縮されてしまっているなどスペキュレーションが成り立たなくもないです。

(無題) 削除/引用 No.1334-6 - 2013/01/14 (月) 19:18:00 - 非特異的分解 Factor Xaで似た経験がよくあります。目的蛋白が、５−１０分の１くらいに減りました。非目的部分との比率は１：１になるはずなのですが。非特異的分解か？　よって、量によっては見えなくなることはあると思います。

(無題) 削除/引用 No.1334-5 - 2013/01/14 (月) 18:51:20 - テップ > > >[Re:2] おおさんは書きました : > 後学のために伺いたいのですが、プロテアーゼがないことはどの様に検証されているのでしょうか。細胞内にいろいろなプロテアーゼがあると思いますが、どの様にしたらそれらをぜんぶ除いたものが得られるのでしょうか? あ、いえ。特にプロテアーゼがないことを確認しているわけではないのですが、Rabbit reticulocyte lysateなのでリソソーム等膜分画を除いているため、通常の細胞ライセートに比べてリソソームプロテアーゼは少ない事や、タンパク質合成のために３７度で３０-60分インキュベートしてますが、その時にはラダーなどは見えないので、分解の影響はほとんどないと思っております。 > > 主に合成時においてですが、せいせい時におきてもおかしくないですよね。 > > 不安定な蛋白では4度でも分解がすすむという感触はあるのですが、、、 TEV proteaseとの4℃でのインキュベートはFLAGビーズのIP後に行っております。ライセート由来のプロテアーゼはほとんどなくなっているはずなので、ビーズに非特異に残ったプロテアーゼでも十分に分解が起こってしまう事があるとすると、厄介ですね。 > 小さいフラグメントもみえないということですが、10ー20ぐらいのペプチドだと、大きい蛋白がトランスファーされている条件ではうまく見えないかもしれません。 タンパク質のドメインにタグを付加した２０kDaのタンパク質を用いております。WBはTricin gelなので、5kDaぐらいの小さいタンパク質でも見えている条件で行っております。タグだけになっていたら、ちょっと見えないかもです。 > そのたんぱくのポリクロとかおもちですか? 残念ながら持ってません。

(無題) 削除/引用 No.1334-4 - 2013/01/14 (月) 11:01:33 - おお >[Re:3] テップさんは書きました : > >[Re:2] おおさんは書きました : > 少なくとも、ラボで使用しているウサギライセート(Rabbit reticulocyte lysate)にはほとんどプロテアーゼもプロテアソームも含まれていないことや、バンドがラダー状になることもなく、４°でインキュベートしているため、分解の可能性も低そうです。 後学のために伺いたいのですが、プロテアーゼがないことはどの様に検証されているのでしょうか。細胞内にいろいろなプロテアーゼがあると思いますが、どの様にしたらそれらをぜんぶ除いたものが得られるのでしょうか? プロメガのRabbit reticulocyte lysateはものによってはプロテアーゼやプロテオソームが問題になるとかかれています。 主に合成時においてですが、せいせい時におきてもおかしくないですよね。 不安定な蛋白では4度でも分解がすすむという感触はあるのですが、、、 小さいフラグメントもみえないということですが、10ー20ぐらいのペプチドだと、大きい蛋白がトランスファーされている条件ではうまく見えないかもしれません。 そのたんぱくのポリクロとかおもちですか? http://www.promega.com/resources/articles/pubhub/enotes/optimize-your-tnt-reticulocyte-lysate-systems-reaction/

(無題) 削除/引用 No.1334-3 - 2013/01/14 (月) 09:24:19 - テップ >[Re:2] おおさんは書きました : > > ProteinXのなかにTEVprotease認識配列がないことは確認されていますよね。場所によってはHAを含む短いフラグメントができ、そこで切れていることも認識できないような場合もあるかもと。。。 > > 経験はないのですが、ウサギライセートにあるプロテアーゼによる分解が起こっている可能性はあるのではないかと。 > > ProteinXじたいがプロテアーゼとかプロテアーゼに結合することが知られていたり、配列上結合する可能性があるとかありませんでしょうか。 コメントありがとうございます。、 ProteinXにはTEV配列が含まれていないことは確認しております。実際にＷＢしても小さい小さい位置にもバンドが見られません。 少なくとも、ラボで使用しているウサギライセート(Rabbit reticulocyte lysate)にはほとんどプロテアーゼもプロテアソームも含まれていないことや、バンドがラダー状になることもなく、４°でインキュベートしているため、分解の可能性も低そうです。

(無題) 削除/引用 No.1334-2 - 2013/01/14 (月) 07:39:43 - おお ProteinXのなかにTEVprotease認識配列がないことは確認されていますよね。場所によってはHAを含む短いフラグメントができ、そこで切れていることも認識できないような場合もあるかもと。。。 経験はないのですが、ウサギライセートにあるプロテアーゼによる分解が起こっている可能性はあるのではないかと。 ProteinXじたいがプロテアーゼとかプロテアーゼに結合することが知られていたり、配列上結合する可能性があるとかありませんでしょうか。

TEV protease 処理後にバンドが消える 削除/引用 No.1334-1 - 2013/01/14 (月) 03:52:53 - テップ 現在、TEV切断によるタンパク質の精製を行っております。 １、ウサギライセートを用いてFLAG-TEV-HA-ProteinXを合成 ２、合成したFLAG-TEV-HA-ProteinXをFLAG-M2ビーズで免疫沈降 ３、免疫沈降したビーズをTev protease溶液（HEPES, KCl, MgCL入り）で4℃　オーバナイトでインキュベート ４、上精をHA-ProteinXを含む溶液として回収 ５、残りのビーズをサンプルバッファーでボイル。 これらのサンプルをHA抗体をWBしました。 １、２からのサンプルからはFLAG-TEV-HA-ProteinXが検出されました。また免疫沈降後の残りのライセートは目的タンパク質がかなり減少していることから、免疫沈降の効率も良いです。 しかし４のTEV protease処理した上精からは何も検出されず、さらに５の残りのビーズにも切れ残りが残っているわけでもなく、なにも検出されませんでした。 なぜかTev protease処理後に目的タンパク質が消えてしまいます。 どのたかこのような現象を経験された方はおりますでしょうか？

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