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(無題) 削除/引用 No.1357-15 - 2013/01/22 (火) 13:13:44 - (ToT) 早速、bigdye 1ul、10ulの系でシーケンスをしてみました。 どのサンプルも全て800bpほど読めており、波形もとても綺麗で 今までの20ulの系となんら遜色ありませんでした。 まだbigdyeのvolumeを減らすことができるとの記述でしたので、 そちらでも試してみようかと思います。 みなさまのお陰で試薬のコストを減らせそうです。 とても助かりました。 >>KENさん PCR後は、Bigdye x-terminatorで精製してます。

(無題) 削除/引用 No.1357-14 - 2013/01/21 (月) 11:54:54 - KEN >Rさん 精製はEt沈は、サンプル数が少量の時は、いまだに私はやってしまいます。 過剰な蛍光色素の除去が悪いとかよく言われますが、エタ沈が原因と思えるような読めないという自体はないんですけどなあ。 >(ToT)さん まあ、とりあえずやってみてはどうですかね？ 今は、精製は何でされているのでしょうか？ 当方もBigdye terminator v3.1節約プロトコールですが、エタ沈でも問題は起きておりません。 数検体だけのシークエンスで量があまりいらないというならば、今までの精製方法を継続されて良いのではないでしょうか？ 安くしたいならば、エタ沈ですが、蛍光色素の除去が悪いと仰られる方もおられるので、そこは自己責任で。

(無題) 削除/引用 No.1357-13 - 2013/01/21 (月) 11:12:06 - ふと それぞれの多少の力量もありますので、 どのくらいまでいけるのか、失敗を恐れてないで やってみてもいいじゃないかなと思うのは私だけ？ 時間も大切。

(無題) 削除/引用 No.1357-12 - 2013/01/21 (月) 11:05:50 - 7744 bigdye 0.4マイクロ/sample 10マイクロの反応系で十分です。 １サンプル２０マイクロの系で、さらに１サンプルにbigdyeを８マイクロ使うなんて、お金を捨てているようなもの。 トータル１０マイクロの反応系でOK。っていうか周りに２０マイクロの反応系でやっている人に会ったことがありません。 次に希釈して使用する場合の注意点を一つ。 以外に知らない人がいるので注意してほしいです。 それは、推奨プロトコルで２０マイクロの反応系で８マイクロ入れるということから逆算すると、bigdye自体が2.5xbufferとなっているということ。これ重要。 つまり、１０マイクロの反応系で0.4マイクロのbigdyeを使用してsequencingするとします。 その時には、１０マイクロ中にbigdyeを0.4マイクロと共に、5xsequenceを1.8マイクロ入れるということになります。 もし0.4マイクロで走りが悪くて、1マイクロに増やしたい場合も上記を考慮して、反応系を組むこと。（この時は1マイクロと1.5マイクロ） 以上の方法で、800以上はきれいに読めます。 もちろんprimerやDNAに左右されます。

(無題) 削除/引用 No.1357-11 - 2013/01/21 (月) 10:38:11 - R 5x希釈バッファーを用いる場合、Dye terminatorは1/8量。 精製はEt沈とPEG沈を行っていました。 10年近く前の話ですが、、、。 今はtemplateとprimer持って行って学内施設に外注してます。

(無題) 削除/引用 No.1357-10 - 2013/01/21 (月) 09:36:44 - 通りすがり 初心様、 コメントありがとうございます。 >精製はマグネットビーズ ちなみにマグネットビーズはどこのメーカーの商品でしょうか？コストは100円/サンプルくらいでしょうか？　ずばりおすすめですか？

(無題) 削除/引用 No.1357-9 - 2013/01/19 (土) 19:54:18 - 初心者 BigDye teminator 0.33uL 5x Buffer 2uL DNA 1ul primer 1uL(4pmol) DDW 5.7uL の混合でいつも行っています。 精製はマグネットビーズで行っています。 シーケンサーによって、検出に差があると思うのでわかりませんが、参考ください。

(無題) 削除/引用 No.1357-8 - 2013/01/18 (金) 19:16:32 - (ToT) 確かに豪気でした。 早く気づいてよかったです。まだそんなにシーケンスはしてなかったので。 v3.1を1ulで試してみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1357-7 - 2013/01/18 (金) 18:04:21 - 通りすがり x-terminatorの代替法を採用するのもコスト削減効果が高そうですね。 例えば私はmerkのpellet paint（半量）でエタ沈精製しています。 横ですが、みなさんはどうされているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1357-6 - 2013/01/18 (金) 18:01:38 - AP いまどきフルスケールでBDの反応をするのがデフォとは、なんと豪気な。 おしゃるような一反応を4 uLにするのなら、単純にプロポーショナルで1/2にスケールダウンすれば、フルスケールとなんら遜色なくできます。 5x希釈バッファーは、今ではBD買うとおまけで付いてきているのではなかったかな？　そうでなくても、home madeのレシピや使用方法はインターネット上に転がっていると思います。1/2スケールで一反応1 uL位まで使用量を減らせますが、いつでもどんなサンプルでもフルスケールと同じくらいうまくいくとは限りません。コツは、スケールダウンとかBDの使用量を減量したからといって、鋳型やプライマーの濃度を下げないこと。

(無題) 削除/引用 No.1357-4 - 2013/01/18 (金) 17:08:31 - (ToT) そうでしたか。 たったの1ulで十分だったのですね。 今までとてつもなく損してました。 ご教授ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.1357-3 - 2013/01/18 (金) 17:00:38 - 774 5x 希釈バッファーが売られています。 これを使えば、10ulあたり、big dye 1ul, 5xBuffer 1.5ulで十分検出できます。 もっと減らせるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.1357-2 - 2013/01/18 (金) 16:45:22 - おお 1/4希釈、すなわち2ulにして、その代わり不足分をバッファーで埋めてもたいがいはうまく行くようです。おプティマイズしたプラスミド(PCRフラグメントはだめらしいですが)では1/32の希釈でもうまく行くというのを見かけたようなきがします。 詳細はぐぐって示そうと思ったのですが、PDFファイルばっかりで、どういうわけか私の今のコンピューターではブラウザでひらけませんのでURLが表示できません。

Bigdye terminatorの節約について 削除/引用 No.1357-1 - 2013/01/18 (金) 16:21:59 - (ToT) シーケンス反応につかうBigdye terminator v3.1が高額なため、 なんとか節約できないかと考えている者です。 今まで、Bigdye terminator v3.1を8ul使って、total20ulでPCRを 行い、そのあとx-terminatorで精製をしていました。 このやり方で、今までシーケンスに失敗したことが全くといっていいほど ないのですが、terminator v3.1の消費量が多いため困っています。 せめてこれを4ulに半減させてシーケンスをしてみたいのですが、 失敗を恐れて試していません。 みなさんは、Bigdye terminator v3.1の節約方法をご存知でしょうか？ 私は今まで使ったことが無いのですが、Bigdye terminator sequencing buffer x5を使って節約したりできるのでしょうか？ もしご存知なら、PCRにかける反応系を教えて頂けるとありがたいです。

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