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(無題) 削除/引用 No.1359-9 - 2013/01/22 (火) 16:11:46 - おお ちなみに、ミニプレップはカラムのきっとを使ってらっしゃるのでしょうか、それともほかの方法でしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1359-8 - 2013/01/22 (火) 14:57:14 - tt 失礼ながら、 手技が下手なのではないか、と。 まずは基本に忠実に。

(無題) 削除/引用 No.1359-7 - 2013/01/21 (月) 14:00:00 - AP pGEXのバックボーンはpBR322で野生型のpMB1 oriですから、pUCなどのハイコピーのプラスミドより、細胞あたりのコピー数が1/10以下です。同じスケールの精製ならコンタミしてくるホストゲノムDNAの量は大差ないですから、コピー数が少ないプラスミドの精製度、S/Nはどうしても悪くなります。コピー数が1/10のプラスミドを、同じ濃度（例えば電気泳動で見えるくらいの濃度）で使用したとしたら、夾雑しくてくるゲノムDNAは10倍多いということですから。

(無題) 削除/引用 No.1359-6 - 2013/01/21 (月) 12:18:59 - gDNA >[Re:2] Harmoniaさんは書きました : > ホストゲノムDNAの混入を疑います。 > Harmoniaさんに１票。 ミニカルチャーの培養時間と温度と液量は？

(無題) 削除/引用 No.1359-5 - 2013/01/20 (日) 11:51:52 - daityoukin 全長６０４６bpです。 pGEX-4T-2にクローニングされたものをDH５αにトランスフェクションしています。 XbaIで１時間半処理しました。

(無題) 削除/引用 No.1359-4 - 2013/01/19 (土) 18:04:03 - おお >[Re:1] daityoukinさんは書きました : > あるプラスミドDNAをDH５αにトランスフォーメーションしてそこからミニプレパレーションを行なってプラスミドを取り出す実験を行なったのですが出来たプラスミドを制限酵素処理し目的の大きさのバンドが現れたところまではいいのですがそれとは別にDNAマーカーの範囲外に10kb以上のバンドが現れました。 > これは一体何なのでしょうか？バンドの形はかなりモヤモヤしています。 > 制限酵素処理後になぜかこのバンドが処理前のモノより大きいところに出るっていう点も気になっています。 > 実際のデーターを含めてもう少し詳細に見てみないとなんともいえないところがあるのだが、、、制限酵素のバファーの影響で大きくなっているように見えるとか、、、でも切れないのもちょっと気になるけど。 miniプレっぷで見えるようなエピソーむもっている大腸菌でもないし、、、 えられたすべてのクローンで同じように見えますか。クローンごとにその高分子のバンドの量がちがいますか?

(無題) 削除/引用 No.1359-2 - 2013/01/19 (土) 15:18:35 - Harmonia ホストゲノムDNAの混入を疑います。 そのプラスミドの全長は何kb？ 使った酵素は？また、期待されるバンドの数と大きさは？

ミニプレパレーション後に電気泳動をして確認したら謎のバンドが 削除/引用 No.1359-1 - 2013/01/19 (土) 13:52:09 - daityoukin あるプラスミドDNAをDH５αにトランスフォーメーションしてそこからミニプレパレーションを行なってプラスミドを取り出す実験を行なったのですが出来たプラスミドを制限酵素処理し目的の大きさのバンドが現れたところまではいいのですがそれとは別にDNAマーカーの範囲外に10kb以上のバンドが現れました。 これは一体何なのでしょうか？バンドの形はかなりモヤモヤしています。 制限酵素処理後になぜかこのバンドが処理前のモノより大きいところに出るっていう点も気になっています。

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