> ウエスタンで２５０ｋD以上は普通はあまりみないところなので25ｋDの意味でしょうか？
> それとも6％のゲルとかで本当に250ｋD以上を見ているんですか？
そうです、10%ゲルで250kより上、wellから少しゲル内に入った位置にバンドが出ます。目的タンパクがかなり大きいサイズなので、wellのすぐ下からブロットしております。
> ビーズは何よ。もしか直接結合させるんじゃなくて、protein A ビーズとか protein Gビーズとかそっち系？。IPは溶出のときにSDS sample bufferとかでやる事多いけど、だとprotein AとかGがちゃんとビーズにくっついてないやつがどうしても一部漏れるのでそれが溶出画分に混入してるんじゃね。Protein A とかって一度変性させても結構タフでwesternの時使う抗体IgGと膜上で反応してラダーというかスメアっぽい強いシグナルを呈すことあるよ。抗体を直接ビーズにくっつけるやつにするか、溶出方法を変性剤でなくて抵pH溶液（pH(2.0)くらい）とかで行うとかで改善すると思う。
なるほど、勉強になります。ご指摘の通りproteinGを使っております。今現在抱えている高分子ラダリングとはサイズが合わないですが、過去のIPを思い返してみるとあてはまることがあるように思います。
> 濃い気がします、色々と。
> 抗体はちゃんとしたモノなのでしょうか。
血清量を見直しましたが確かに過剰と言える量でした。ひとまず精製したIgGでIPをしたところかなり改善されたのですが、なお4,5本ラダー状のバンドが見られます。近々別のウサギポリクロ血清が届くので、抗体に問題があるのか、手順等に問題があるのか、いま一度確認したいと思います。 |
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