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(無題) 削除/引用 No.1371-13 - 2013/01/31 (木) 17:09:26 - green 通常、IPサンプルからは、複数（時には１００以上）のタンパク質が同定されます。 濃縮目的ならば、こんなものもあります。 http://advansta.com/Afyon/?root=337 ソリューションダイジェッションよりも、少しだけ泳動（ゲル内濃縮）してin Gelダイジェッションの方が効率は良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1371-12 - 2013/01/26 (土) 13:18:58 - おお >[Re:11] qうぇrちゅいおp＠さんは書きました : > だな、２が指摘してるように、それ蛋白質じゃなくてその難溶性の塩の沈殿とおもう。ていうか普通のIPで目に見えるほどというか溶けないほどの沢山の蛋白質がとれてくるって、俺の中では日常的にはあり得ない気がする。 正直私もそんなきがしますね。沈殿をけんだくした際にリカバリーをチェクして見てもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1371-11 - 2013/01/26 (土) 06:06:53 - qうぇrちゅいおp＠ だな、２が指摘してるように、それ蛋白質じゃなくてその難溶性の塩の沈殿とおもう。ていうか普通のIPで目に見えるほどというか溶けないほどの沢山の蛋白質がとれてくるって、俺の中では日常的にはあり得ない気がする。 ipしたビーズを少量の8M urea含む適当な重炭酸アンモニウム液にけんだくして補捉した蛋白質を溶出するということではどうよ。ていうか液量を少なくすれば濃縮とか必要ないだろ。外注ならこれを送ればいい。後のプロテアーゼ分解やMS解析を考えた時SDSの使用はあまり適切でない気がする。ちょっと気になるのはDNAと蛋白質の架橋は切らないでそのままでいいのかな、というかペプチド断片の分析後のデータ解析の際に問題ないのかな。こういう目的のMS分析に精通してるところに相談してからやった方がいい気がする。

(無題) 削除/引用 No.1371-10 - 2013/01/25 (金) 03:54:04 - おお 直接ならIPフラクション(溶液を含まない)をon gelでトリプシンで処理してLCにかけることは可能かと。 SDSPAGEにかけ、サンプルがセパレーションげるに移った直後にエイどうをとめて、ゲルからMASにもっていくてもあるかと。NP40とかも邪魔になるそうなので。

(無題) 削除/引用 No.1371-9 - 2013/01/25 (金) 03:45:36 - おお TCAは必要ないのではないようなきがします。IPフラクションをそのままLC/LC/MASに持っていけばとおもいます。まあ抗体がドミナントなのがきになりますが、これはTCAしてもおんなじです。 SDSはRIPAバッファーの持ち込みでしょうか?ならさいごに界面活性剤フリーのバッファーで何回かあらえばどうでしょうか。 TCAちんでんでDNAが混入しているようでしたら、リカバリーがよくないことはよくあるように思います。DNAseでしょかというのもありかもしれませんが、操作が増えて、うまく行くのかという不安も、、、

(無題) 削除/引用 No.1371-8 - 2013/01/24 (木) 20:52:15 - 凍 > やはり溶出後のダイレクトにMSというのは厳しいのでしょうか？ いいえ。電気泳動なしでも行くそうです。そのほうが感度がいいといわれましたけど。(その後のシステムがしっかりしている場合だと思います。） > それと素人質問で申し訳ないのですがSDSローディングバッファーはSDS-PAGEの泳動のための > バッファーということでしょうか？ > はい。

(無題) 削除/引用 No.1371-7 - 2013/01/24 (木) 20:43:08 - aaaaaaaa 凍様 やはり溶出後のダイレクトにMSというのは厳しいのでしょうか？ それと素人質問で申し訳ないのですがSDSローディングバッファーはSDS-PAGEの泳動のための バッファーということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1371-6 - 2013/01/24 (木) 20:39:05 - aaaaaaaa qq様 参考文献熟読してみます。ありがとうございます。 確かにバックは高いことは予測されます。 しかし、現段階ではその懸念以前のテクニカルな面で苦戦しているので、、不甲斐ないです。 内々の話で恐縮なのですが、その委託先のオペレーターもMS屋というわけではなく、ただ機械を動かすテクニシャンのため、標準的な重炭酸アンモニウムに溶解→アルキル化→トリプシン処理だけの指定であり、タンパク沈殿に関する知識は乏しいようです。そのため、オペレーターと試行錯誤している状態です。。。 どうしてもタンパク沈殿後の溶解段階でいつも頭打ちしている状況なのです。 まだまだ勉強不足を痛感しています。

(無題) 削除/引用 No.1371-5 - 2013/01/24 (木) 19:09:05 - 凍 TCA沈殿はそのようなへんなことが起きるので、普通は凍結乾燥じゃないですかね。IPですでに濃縮されているので、少量のSDSローディングバッファー溶出、それを凍結乾燥のマシンで５０−１００ulに濃縮、電気泳動、MASSでうまく行きました。少量のSDSローディングバッファーが少なければ、濃縮さえ必要ありません。

(無題) 削除/引用 No.1371-4 - 2013/01/24 (木) 17:43:47 - qq まあ、せっかくなので、こんなのが参考になるかもしれません。 PMID: 23295261 特異的な結合タンパクの分子量などが既に判っていることが、必要かもしれません。ChIPもノンスペがそれなりに多そうに思うのですが、IPをザバッとLC-MSに持って行くのも、賭けだなあと思います。 LC/MS/MSを委託するのであれば、委託先にいろいろな条件を聞かないとダメじゃないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1371-3 - 2013/01/24 (木) 16:55:16 - aaaaaaaa qq様ー アドバイスありがとうございます。 情報不足で申し訳ありません。 タンパクはIPを行ったものです。 TCA沈殿の目的は、タンパクの濃縮です。少量のタンパクなので濃縮を行ってMSにかけようと考えています。TCA沈殿を用いるのはDNA/タンパクを架橋しているため、MetOH/クロロホルム沈殿ではDNA層に目的DNA/タンパクが存在してしまい、濃縮できないと考えたため、TCＡ沈殿を採用しました MSに関してはド素人なので委託になるのですが、LC/MSということしかわかりません。

(無題) 削除/引用 No.1371-2 - 2013/01/24 (木) 10:13:20 - qq 状況がみえません。以下の三点について問い直されてはいかがでしょう？ 1) タンパクは、ほぼ純品なのですか、それともIPしたものでしょうか、はたまた細胞抽出液でしょうか？ 2) TCA沈殿の目的はなんでしょうか？そして目的は達成できましたか？ 3) MS解析は、どのような方法を用いる予定なのでしょうか？そこで、TCA沈殿は必須なのですか？ 私なりに溶けない原因と解決策ですが、 a) Gu-HClで溶解する時は、SDSがTCS沈殿で完全に除去されている必要があります。SDSはGuHClと強く結合し、不溶物を形成します。TCAの残っている沈殿に重炭酸Naを入れると、中和できるまで、炭酸ガスを発生させます。 b) 溶解困難な沈殿は、沈殿の体積に比べて表面積が小さいことが一つの原因です。 c) 以上、二つの問題点を解決するためには、TCA沈殿したサンプルをEtOHで一回リンスし、沈殿に残存するTCAとSDSを除去します。更に真空乾燥し、薄いフィルム状に乾燥させると、溶解が比較的楽になります。サンプルが多すぎると、フィルム状にならないので、ある程度サンプル量が少ないことが必要です。エッペンは、先細りのエッペンよりも丸底の（2mlの）エッペンの方が良いかもしれません。エッペンは、材質により、沈殿が広がった沈殿になったり、1ヶ所に集積した塊になったりします。その意味では、低吸着のエッペンが最良とは限らないと思います。

TCA沈殿後のMS解析 削除/引用 No.1371-1 - 2013/01/23 (水) 23:54:32 - aaaaaaaa タンパクをTCA沈殿後(TCA沈殿前のバッファーには0.1%SDSが含まれ、容量は600ulです)、MSのバッファー(重炭酸アンモニウムまたは5M Gu-HCl)に溶解しているのですが、タンパクペレットが完全に溶解してくれません。 白く白濁したり、塊を作ってしまいます。重炭酸アンモニウムにUreaを加えても結果はほとんど変わらず、遠心するとペレットが再度出現する状態です。 MSに詳しい方が研究室室におらず、現在苦戦している状況です。 どなたかアドバイスいただけませんか。

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