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シクロヘキシミドを使った半減期の研究について トピック削除
No.1372-TOPIC - 2013/01/24 (木) 01:40:48 - neko
いつも大変お世話になっております。
シクロヘキシミドを使い、あるタンパクの半減期を調べたいと思っているのですが、うまくいきません。HEK293T細胞を使用し、Transfectionで目的タンパクを発現させ、Transfection後48時間でシクロヘキシミドを20-100ug/mlの濃度で通常の培地（DMEM+FBS+PS）に添加したものに置き換え、0-24時間の範囲でWesternBlot用のサンプルを回収し、タンパク発現を見ています。しかしWBでのタンパクの発現はシクロヘキシミドを添加しても全く変化がなく（添加前に回収したサンプルと全く同じ）、困っています。過去の文献では、そのタンパクは半減期2時間で、その際のシクロヘキシミド濃度も20ug/mlを使用しており、内因性タンパクだけでなく、同じ強発現のモデルでも調べていました（ただし過去の文献はHela細胞やMCF10を使用していました）。私の実験ではシクロヘキシミドを添加して24時間たっても、293T細胞が死んだりすることもなく、そもそもシクロヘキシミドが効いているのかも疑っています。同様の研究で、シクロヘキシミドを添加した場合、回収時にはいくらかの細胞死が見られるべきなのでしょうか？また培地にFBSが入っていますが、このような添加物はシクロヘキシミドの作用に問題ないのでしょうか？お忙しいところをお手数ですが、アドバイスが頂ければありがたいです。よろしくお願いします。
　
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ありがとうございます 削除/引用
No.1372-7 - 2013/01/24 (木) 23:11:45 - neko
皆様

お忙しい中、色々なご提案やご教示を頂き大変勉強になりました。
この実験はタグの付いたタンパクをCMVプロモーター下で強発現させて、タグ抗体を用いてWBで発現を確認しています。強発現のため、ご指摘の通り、分解系が追い付いていないのかもしれません。ご指摘頂いたPulse Chase等、別の方法でも確認をさせて頂こうと思います。また何かございましたらよろしくお願い申し上げます。

まずは、 削除/引用
No.1372-6 - 2013/01/24 (木) 22:10:49 - A
シクロヘキシミドが効いているか、確かめてみてはどうでしょうか。

35S-Met, Cysで全新規合成タンパクをラベルして1時間ほどチェイスし、SDS-PAGEで流してみれば、すぐにわかります。

(無題) 削除/引用
No.1372-5 - 2013/01/24 (木) 20:14:31 - Harmonia
ちょっとした疑問です。
観察されたタンパク質はtransfectionで発現させたもののみを見ていますか？
先行事例の内在性云々を言われているので、そうだとは思いますが。

ベクターはlarge Tで増えるタイプですか？そうなら、発現させたタンパク質
が多すぎて、分解するのが追い付いていないのかも。

(無題) 削除/引用
No.1372-4 - 2013/01/24 (木) 19:16:04 - KY
シクロヘキシミドを２４時間ぐらい処理しても、細胞はなぜかあまり死なないですよね。見た目ちゃんとへばりついてます。ピューロだと２４時間で浮いてくるので、何が違うんですかね。

シクロはFBS入りでもちろん効きます。
とりあえず、もっと長時間２−３日入れて見て、あきらかに増殖が抑制されていれば、シクロが効いている事ぐらいは確認できるか。

molecule of your interestに依存する 削除/引用
No.1372-3 - 2013/01/24 (木) 15:41:13 - in+vitro
当然ながら発現量が下がっても生存に重要でなければ死にませんよ。
それから念のためRT-PCRもしてみたら？

(無題) 削除/引用
No.1372-2 - 2013/01/24 (木) 15:08:00 - おお
HEKを50ー100ug/mlで処理したことがありますが。O/Nで平気な顔してました。まあ細胞が生きていて見かけ正常な活動をしていそうなので、そういう意味では実験系は完ぺきなものではないですね。それを頭に置いておいてみんな実験しているはずでしょうけど、、、

シクロヘキシミドを使った半減期の研究について 削除/引用
No.1372-1 - 2013/01/24 (木) 01:40:48 - neko
いつも大変お世話になっております。
シクロヘキシミドを使い、あるタンパクの半減期を調べたいと思っているのですが、うまくいきません。HEK293T細胞を使用し、Transfectionで目的タンパクを発現させ、Transfection後48時間でシクロヘキシミドを20-100ug/mlの濃度で通常の培地（DMEM+FBS+PS）に添加したものに置き換え、0-24時間の範囲でWesternBlot用のサンプルを回収し、タンパク発現を見ています。しかしWBでのタンパクの発現はシクロヘキシミドを添加しても全く変化がなく（添加前に回収したサンプルと全く同じ）、困っています。過去の文献では、そのタンパクは半減期2時間で、その際のシクロヘキシミド濃度も20ug/mlを使用しており、内因性タンパクだけでなく、同じ強発現のモデルでも調べていました（ただし過去の文献はHela細胞やMCF10を使用していました）。私の実験ではシクロヘキシミドを添加して24時間たっても、293T細胞が死んだりすることもなく、そもそもシクロヘキシミドが効いているのかも疑っています。同様の研究で、シクロヘキシミドを添加した場合、回収時にはいくらかの細胞死が見られるべきなのでしょうか？また培地にFBSが入っていますが、このような添加物はシクロヘキシミドの作用に問題ないのでしょうか？お忙しいところをお手数ですが、アドバイスが頂ければありがたいです。よろしくお願いします。
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