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(無題) 削除/引用 No.1378-10 - 2013/01/26 (土) 19:25:01 - おお まずはその30AAでdepletionをする。 違うライセーとでその30AAをまぜてくろまとにかける。30AAは何もついてない状態のほかにコンプレックスをとったフラクションが得られるだろうから、そのフラクションをdepletionした系にまぜて移行するか確認する。 というのをおもいつきました。 イーストなどをりようして、その30AAと何かをつなげ、それが移行すれば光るとか蛍光活性がかわるとか、死ぬとか言う系をつくって、KOライブラリーをスクリーニングするとか。 死ぬというようなけいであればマンマルの細胞でもsiRNAライブラリーをつかってレスキューするものを探せば輸送にかかわる遺伝子は拾えてくる可能性はまあまああると思う。

(無題) 削除/引用 No.1378-9 - 2013/01/26 (土) 17:00:05 - -- クロマトグラフィーを多段階でかけて同定、というのは最近は実行する人が少ないと思いますが、もちろん可能です（運が良ければ）。 他のアフィニティーを使った方法がうまくいかないが、活性は見られる場合に考えるという感じでしょうか。 クロマトや硫安分画などを最低、3-4段階精製をかければ、MSで候補が絞れる可能性があります。 もちろん何回精製をかけるかは運と腕次第でしょう。 タンパク精製にある程度慣れていて、色んな原理のクロマトを知っていること、ペプチドMSについてもある程度深く理解していることが必要だと個人的には感じます。 クロマトを多段階ではなく、1回ずつかけて活性のあるフラクションをMS解析というのを色々なカラムで行い、集合をとって同定、という方法も見たことがあります。

(無題) 削除/引用 No.1378-8 - 2013/01/26 (土) 16:49:18 - qq ＞そうすると他にどうやったら活性タンパク質Ｚを見つけられるのかと考えております。 Zは、タンパクであるとは限らない。ATPやlipidsとか、ね。地道にやるしかないだろうね。

(無題) 削除/引用 No.1378-7 - 2013/01/26 (土) 14:45:16 - せいか >[Re:5] qqさんは書きました : > ＞蛋白質Xをin vitro合成してから精製して、in vitroの系で目的のオルガネラに移行するのかをみている、 > のだから、ここで生化学的な方法でZを無理やり探さないで、タンパクXのmutagenesisをかけるとか、分子生物的な方法でタンパクZと相互作用しそうな部位を探す方が先なんじゃないでしょうか？ > vivoで見れるともっと良いかもしれませんが、Xのシグナル配列をGFPに入れるようなことは既に試されているのでしょうか？ はい。すでに３０アミノ酸ぐらいのドメインだけで移行できることを確認しております。このドメイン自体がその移行に必要なことは一般的にも知られているのですが、なぜ選択的に移行できるのか不明なんです。とりあえず、このドメインだけで結合する因子をＩＰして電気泳動して、特異的なバンドを見つけたのですが、マス解析したところ、どうも関係のないタンパク質のようでして。そうすると他にどうやったら活性タンパク質Ｚを見つけられるのかと考えております。 確かに、もっと結合する条件を改良して、本物の機能的結合タンパク質を見つけることが一番確実ですよね。

(無題) 削除/引用 No.1378-6 - 2013/01/26 (土) 10:31:15 - おお >in vitroの系で目的のオルガネラに移行する この系がどんなものか分かりませんが、そのオルガネラをふくむ細胞からの抽出液みたいなものでしょうか。 それならいろいろな細胞で抽出をおこなって、移行活性が顕著に弱いものがあれば、それにいろいろなフラクションを加えて活性を見る手は取れますよね。一つだけ確かめないといけないのは移行活性が弱いのが抑制因子によるものなのか、単に移行活性因子がないためなのかです。これは活性ある抽出液をと混ぜたりすると様子が探れると思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.1378-5 - 2013/01/26 (土) 09:41:20 - qq ＞蛋白質Xをin vitro合成してから精製して、in vitroの系で目的のオルガネラに移行するのかをみている、 のだから、ここで生化学的な方法でZを無理やり探さないで、タンパクXのmutagenesisをかけるとか、分子生物的な方法でタンパクZと相互作用しそうな部位を探す方が先なんじゃないでしょうか？ vivoで見れるともっと良いかもしれませんが、Xのシグナル配列をGFPに入れるようなことは既に試されているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1378-4 - 2013/01/26 (土) 03:15:29 - おお >[Re:3] せいかさんは書きました : > コメントありがとうございます。 > > やはり活性フラクションを見つけても、その中のZを同定するのはなかなか骨が折れそうですかね。 > 結合量が上がる事を願ってクロスリンクを使って、IPしてみようと思います。 活性フラクションがみつけられるなら、IPとかで結合見るより早いと思いますが、、、しっかりした活性の検出けいがあるかどうかだとおもいますが。。。

(無題) 削除/引用 No.1378-3 - 2013/01/25 (金) 19:11:12 - せいか コメントありがとうございます。 やはり活性フラクションを見つけても、その中のZを同定するのはなかなか骨が折れそうですかね。 結合量が上がる事を願ってクロスリンクを使って、IPしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1378-2 - 2013/01/25 (金) 05:36:15 - おお なんともいえませんね。ゲル濾過などでXのタンパクのフラクションをおって、それと一緒の挙動を示すタンパクをしらべたりなどできることはできますが、かといってZが同定されるかどうかはだれにもよげんできないでしょう。 多角的なアプローチを考える必要があるとおもいます。結合するタンパクをみつけるなら、クロマトなどによるコンプレックスのかいせき、Y2H、IPフラクションのMASなどいろいろありますし、それぞれどのように優先順位をつけるのか、データーをどの様に利用するのか考えてみたらいいかと思います。同時にY2H以外では実際にどの様な状態のサンプルがベストなのかもよく考えるといいかもしれません。 またトランケートな変異体をつくりそのトランスポートにかかわるだろうドメインが同定できるなら、そのドメインだけ使ってY2Hやコンプレックス解析が可能になりより回答に近い結果が得られるかもしれません。 in vitro reconstitutionの実験がどこまで再現できるのか分かりませんが、それと生化学的精製を組み合わせて活性フラクションを探るのもひとつのアプローチではないかと思いますし。 オルガネラトランスポートの研究は今始まった訳ではありませんので、知られているpathwayからどれがresponsibleなのか探っていってそこから全体のトランスポートのされ方を解明していくこともアプローチではないかとも思います。

細胞抽出液から目的蛋白質の生化学的抽出と同定 削除/引用 No.1378-1 - 2013/01/25 (金) 05:09:46 - せいか ある蛋白質Xが目的のオルガネラにどのように移行するのか実験しております。 蛋白質Xをin vitro合成してから精製して、in vitroの系で目的のオルガネラに移行するのかをみていると、精製した蛋白質Xだけでは移行できません。しかし蛋白質Xに細胞質抽出液を加えると移行がみられます。 よってこの細胞質に含まれる目的蛋白質（活性蛋白質Z）を単離したいと計画しております。 単純に蛋白質Xの結合蛋白質を調べたのですが、いまいちそれらしいものはとれませんでした。おそらく一過性な結合で目的のオルガネラにシャトルして、すぐに離れてしまうようなものだと思っております。 よって細胞質抽出液をゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換HPLCなどを使用して活性のあるフラクションを見つけて、活性蛋白質Zを同定したいと思います。ですが、このような生化学的分離の経験がないため、実際にできるのか不安です。（当ラボもまったく経験者がおりません） 実際に、うまく活性のあるフラクションを同定したとして、それを質量分析に掛ければ、１０個ぐらいの候補に絞ったりすることはできるのでしょうか？ 初心者に是非アドバイスを頂けると助かります。

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