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(無題) 削除/引用 No.1382-9 - 2013/02/05 (火) 19:28:57 - ＬＤＬ Ｕさん 的確で素晴らしいアドバイス、ありがとうございます。 Ｕさんのおっしゃる通り、クライオスタットで作成した凍結切片を染色しました。 ポジコンは老齢化した同じマクロファージ系の細胞です。 文献では老齢化すると、蓄積されるとあり、実際に染めたところ文献通りに染まったので、ポジコンとして使用しました。 私も、何度やっても幾度観察しても存在しないので、 陰性として判断しているところでした。 ありがとうございます。 もう一度よく考察し、上司の方に、別方向での方針を提言しようと思います。 また、Ｕさんのおっしゃる通り、電顕像が得られているのはこちらとしても大きなデータです。後日、投与系をつくり、再度電顕画像をとって注意深く観察してみようと思います。Ｕさんが書いてくださったアドバイスも参考にしつつ、なんとか、新しい知見にたどり着けるよう頑張ってみます。 ありがとうございました。とても参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.1382-8 - 2013/02/05 (火) 17:20:22 - U 組織切片で見られているのであれば、切片の準備過程（凍結切片ですよね？）の方が影響するように思いますが、ポジコンの組織（脂肪組織でしょうか？）で染まっているという事は、LDLさんが見ている細胞はOil Red-O陰性で、泡沫化マクロファージや脂肪細胞は否定的と考えて良いと思います。泡沫化マクロファージはOil Red-Oで染まると思います。 標的となる細胞が「マクロファージ系」である事が確認されていて、すでに電顕での観察が済んでいるのであれば、こちらから掘り下げるのも手かもしれません。蜂の巣状にみられる顆粒はelectron denseなのかelectron lucentなのか、顆粒の膜はどうなっているのか、顆粒内にさらなる小顆粒を内包しているのかどうか（microvesicular body)、などによって色々な可能性があると思います。もし、蜂の巣状に増えている顆粒構造がLysosome由来であると判断できるのであれば、late endosome やlysosomeからcytosol/ERへのLipidの細胞内輸送に問題があるかもしれません。その場合は遊離型のコレステロールがlysosomeに蓄積している可能性があり、Filipin染色は有用ですが、私自身は組織切片でのFilipin染色はやった事がありません。 ご参考になれば、幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1382-7 - 2013/02/05 (火) 10:50:44 - ＬＤＬ 追記させていただきます コレステロールエステルとコレステロールはOil Rad O染色で、（＋）室温では陰性。溶解した場合のみ陽。 と記載されていました。

(無題) 削除/引用 No.1382-5 - 2013/02/05 (火) 10:29:23 - ＬＤＬ Uさん 返信が遅くなって申し訳ありません 詳しく、またわかりやすい解説をしていただき、ありがとうございます。 研究の経緯を話させていただきますと、 私は現在vivoで、衛生系の研究をしています。 ある物質を投与した際、標的となる細胞にどのような影響があるか というものです。 標的となる細胞はマクロファージ系で消化顆粒が存在しています。 電子顕微鏡での観察では、その顆粒が 蜂の巣のような構造（泡沫化？）しており、何らかの物質が蓄積していると考察しました。 その考察では、蓄積物は脂質であると仮説をたてました。 そこで、Oil red O染色、 Sudan Black B染色で染めたところ、一切染色されませんでした。なお、陽性対象の個体では非常によく染まりました。 病理組織標本の作り方　第5版　監修　景山圭三・渡辺陽之　に、 Oil red O染色では、コレステロールおよびコレステロールエステルは室温では染色されないと記載されており、コレステロール類の蓄積が考えられました。 しかし、他の文献を調べるとvitroではありますが、泡沫化したマクロファージや酸化LDLを投与したマクロファージをOil Red O染色で染めており、私としては混乱しました。 そこで細胞内に蓄積したコレステロール類の染色方法を探り、ここに記載する今に至るというわけです。 Ｕさんの疑問に則しているかわかりませんが、このような経緯で調べさせていただいております。 どうぞ、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1382-4 - 2013/01/31 (木) 07:35:10 - U 「細胞内のLDLコレステロール」とは、マクロファージなどがエンドサイトーシスで取り込んだLDL内にとどまるコレステロールを意味するのであれば、コレステロールエステルなので、Filipinでは染まらないと思います。もしlate endosomeでacid lipaseにより加水分解された遊離コレステロールを見たいのであれば、Filipinも使えるかもしれませんが、この時点でLDLはすでに分解されているので、「細胞内のLDLコレステロール」を見たいという質問者さんの意図に合うかはわかりません。Oil red-Oでコレステロールエステルを染める事ができますが、例えば泡沫化マクロファージの場合は、early endosome内のLDLよりもlipid dropletに蓄積されたコレステロールエステルを主に見る事になると思います。LDLそのものを見たいのか、LDLに由来する「コレステロール」を見たいのか、また、後者であれば、コレステロールエステルを見たいのか、遊離コレステロールを見たいのか、この辺りがはっきりすると答えやすくなると思います。 ちなみに、Filipinは蛍光顕微鏡で検出しますが、蛍光強度がかなり弱く、少々難儀です。Lipid dropletを見るので良ければ、Oil redの方が使いやすいと思います。もし、培養細胞をお使いなら、蛍光標識されたLDL、oxLDL、acLDLなど市販されているので、細胞に取り込ませて蛍光顕微鏡で観察可能です。

(無題) 削除/引用 No.1382-3 - 2013/01/28 (月) 18:20:08 - LDL KENさん ありがとうございます Filipin染色については初めて聞きましたので、 調べてみようと思います また、免染での市販の抗体では、 ヒトへの反応性はみられたのですが、 マウスへの交差性がわからなかったので、 今回は見送ろうと思います

(無題) 削除/引用 No.1382-2 - 2013/01/26 (土) 22:19:21 - KEN コレステロールの染色でしたら、Filipin染色はどうでしょうか？ また、酸化LDLでしたら抗体があると思いますが、免疫染色はいかがでしょう。

Oil Red Oによるコレステロールの染色 削除/引用 No.1382-1 - 2013/01/26 (土) 16:42:38 - ＬＤＬ はじめまして 現在、私はOil Red O染色を用いて、 細胞内の脂肪の染色、特にコレステロールの染色を試みています そこで質問なのですが、 細胞内のLDLコレステロール あるいは、酸化LDLはOil Red O染色によって 染色されるのでしょうか？ 37℃で染色した場合など、 特殊な場合でしか染まらないのでしょうか？ 私の調べた文献では、Oil Red O染色の、 コレステロールに対する染色性は 常温で陰性と書かれていました。 また、別の文献を見ると、 酸化LDLを貪食し、泡沫化したマクロファージを Oil Red O染色で染めていました。 Oil Red O染色で細胞内の酸化LDLあるいはLDLを染めるには どのようにすればいいでしょうか。 どなたか、アドバイスのほど よろしくお願いいたします。

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