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(無題) 削除/引用 No.1393-21 - 2013/02/04 (月) 05:13:20 - おお >[Re:20] えさんは書きました : > いえ、なぜストレートに細胞表面からではないのか？と。 > 確かウイルスやバクテリアの核酸に対するレセプターも、細胞膜ではなくエンドソームに局在している気がしますが、関係ないかな。 そうですね。面白い視点だと思いました。いろいろスペキュレーションはできますけど、空想を膨らまし過ぎてもと思いますので書きませんが、何か情報が得られたら書き込んでみようとはおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1393-20 - 2013/02/03 (日) 19:11:29 - え いえ、なぜストレートに細胞表面からではないのか？と。 確かウイルスやバクテリアの核酸に対するレセプターも、細胞膜ではなくエンドソームに局在している気がしますが、関係ないかな。

(無題) 削除/引用 No.1393-19 - 2013/02/03 (日) 14:02:42 - おお そこまではわかりませんね。まあ商品カタログ程度の知識しかありませんから。でその根拠はおっしゃっているクロロキンなどの実験からきているんでしょう。 なにかそれに否定的な実験や現象があるんでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1393-18 - 2013/02/03 (日) 13:42:31 - え おそらく、クロロキン、硫酸アンモニウムでトランスフェクションの効率が上がり、エンドソーム内にDNAが取り込まれているのが見えるから、という根拠だと思います。例えば、 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0005273694900663 しかし本当にエンドソーム経由なのでしょうか？？？

(無題) 削除/引用 No.1393-17 - 2013/02/03 (日) 09:34:20 - おお http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Transfection/transfection-methods/Lipid-Transfection.html The transfection complex is thought to enter the cell through endocytosis. Endocytosis is the process where a localized region of the cellular membrane uptakes the DNA: liposome complex by forming a membrane bound/intracellular vesicle. Once inside the cell, the complex must escape the endosomal pathway, diffuse through the cytoplasm, and enter the nucleus for gene expression. Cationic lipids are thought to facilitate transfection during the early steps of the process by mediating DNA condensation and DNA/cellular interactions.

(無題) 削除/引用 No.1393-16 - 2013/02/03 (日) 09:31:27 - おお >[Re:15] えさんは書きました : > リポフェクションのDNA進入経路ががエンドソーム経由だと示した論文はありますか？ > DNAがエンドサイトーシスされている写真は見かけますが、細胞質への進入がエンドソームからであることを示した論文はあるのでしょうか。 > 経路が細胞膜ではなくエンドソーム膜であることの生理的な理由も述べられていますか？ 何かご存じのことがあればお教え願いますか?

(無題) 削除/引用 No.1393-15 - 2013/02/03 (日) 09:11:43 - え リポフェクションのDNA進入経路ががエンドソーム経由だと示した論文はありますか？ DNAがエンドサイトーシスされている写真は見かけますが、細胞質への進入がエンドソームからであることを示した論文はあるのでしょうか。 経路が細胞膜ではなくエンドソーム膜であることの生理的な理由も述べられていますか？

(無題) 削除/引用 No.1393-14 - 2013/02/03 (日) 05:17:16 - おお >[Re:13] なでしこ組さんは書きました : > > > 脂質の膜融合という点で少しは理解がはれたかなと思います。。。。 > > 膜融合で細胞に取り込まれてる例なんてあるかな。 > 通常は脂質と核酸の凝集物のエンドサイトーシス経由でしょう。 > ウイルス由来の膜融合ペプチドとかの機能を借りて、エンドソームから細胞質への脱出の際に膜融合を利用しているものならあります。 DNA導入試薬はエンドソーむみ取り込まれるようですね(直接文献を調べたわけではないですけど). ウイルすも細胞表面のリセプターを利用しているものもおおいので、初期の段階ではエンドサイトーシスが起こっているかもしれませんね(ぐーぐるイメージ検索では細胞表面の膜融合と一度エンドソームにとりこまれる模式図両方みられます)。 ウイルスにしろ、今回のリポソームにしろエンドソームに入った場合、内容物を細胞に放出するためにはエンドソームを壊し、自らの膜構造も壊すか、エンドソームと融合してしてしまって内容物を放出するかのプロセスが必要なのはたしかですね。 詳しいものではないので、空想の部分もおおいので参考程度にしていただければうれしいです。

(無題) 削除/引用 No.1393-13 - 2013/02/03 (日) 00:46:02 - なでしこ組 > 脂質の膜融合という点で少しは理解がはれたかなと思います。。。。 膜融合で細胞に取り込まれてる例なんてあるかな。 通常は脂質と核酸の凝集物のエンドサイトーシス経由でしょう。 ウイルス由来の膜融合ペプチドとかの機能を借りて、エンドソームから細胞質への脱出の際に膜融合を利用しているものならあります。

(無題) 削除/引用 No.1393-12 - 2013/02/02 (土) 13:58:39 - おお 実際のところネガティブチャージの細胞膜にネガティブチャージのリポソームがどのようにあくせするのかという点には興味がありますね。 まあ細胞表面は脂質だけでできている訳ではないでしょうから、アクセスできるのだと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.1393-11 - 2013/02/02 (土) 13:29:05 - はな 皆様ありがとうございます。 遺伝子導入にはカチオンが必要とずっと思っていたので不思議でしょうがなかったのですが、 脂質の膜融合という点で少しは理解がはれたかなと思います。。。。

(無題) 削除/引用 No.1393-10 - 2013/01/31 (木) 21:52:23 - なでしこ組 >[Re:8] はなさんは書きました : > マイナスのリポソームの中に、マイナスチャージが大きいDNA（pTT）を内封することができるのか？？と思いました。電荷の反発によって内封できるものなのですか？ 素晴らしい洞察です。 カチオン性脂質からなりリポソーム形成能を詠ったトランスフェクション試薬がありますが、DNAと混ぜた状態では、その強いクーロン力によりリポソーム構造は維持できず、実際にはラメラ状の凝集物になっていることが分かっています。未だにリポソームという単語を使っているいい加減な説明があるのは残念です。 提示の論文では、入れてるのが低分子のpTTですから、添加量次第ではリポソーム構造が保てるのかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.1393-9 - 2013/01/31 (木) 08:44:07 - おお >[Re:8] はなさんは書きました : > > となっており、空のリポソームの電荷はマイナスと考えました。 > マイナスのリポソームの中に、マイナスチャージが大きいDNA（pTT）を内封することができるのか？？と思いました。電荷の反発によって内封できるものなのですか？ これも確認せずに書きますので、論文にもどって検証してみていただきたいのですが、ない封といっても、もともとあるリポソ-ムの中に入れるのではないですよね。物によってはシート状フィルムにしておいて、ない封したいものを含んだ溶液を加えたりするわけですから、リポソームの形成は溶液中でなされるんだとおもいます。たとえばプールにビニールシートをいれて、巾着のようにくくっちうようなイメージだと、内容物はプールの外のものと一緒ですね。 vehicle size of 133.6 ± 2.8 nmとかいていますし、pTTは thymidineが2つですよねよく分かりませんが2-3nmぐらいでしょうか、、、どの程度大きさにさがあればネガティブの反発が顕著になるのかわかりませんが、水分子の電荷のかたよりも中和に働くでしょうし、、、 > 私の浅はかな知識では、負電荷のリポソームは、例えばDNAとPEIなどとcomplxを調製しプラスチャージにしてから静電的相互作用によって内封できるものかと思っていました。。。 何か参照にしているものがあれば後学のためにお教え願えませんでしょうか? > > そもそもpTTはマイナスチャージが大きいためキャリアとしてリポソームに内封させたとintoroductionでは書かれてあるのですが、同じリポソームがマイナスチャージなら同じじゃないかと思ったんです。。 まず電荷をもったものはプラスでもマイナスでも基本的に細胞膜を通過しにくいです(特に脂質など疎水性の部分が大きかったりしない限り通過しないといっていいかもしれません)。なので細胞内に送り込む手段が必要になるわけです。 リポソームは細胞膜に融合したりする性質を利用できるのでならばリポソームの中に物をいれれば細胞内に入るだろうということだと思います。 一方DNAを導入するCationic liposomesは、lipofectamineなどの模式図ではリポソームの外側のプラスチャージにDNAをくっつけているような図があり、このようなタイプのものは、必ずしも内封されていなくても、コンプレックスを導入できるようになっているみたいです。

(無題) 削除/引用 No.1393-8 - 2013/01/31 (木) 08:03:03 - はな 皆様ありがとうございます！ 質問者です。 DOPEは中性脂質だと思っていました。そしてCS3によってネガティブチャージにしているのかと。。。 私の考えというか疑問は Table１では 「empty DOPe/cholesterol-3-sulfate Zeta potential (mV)　−63.17 ± 4.11」 となっており、空のリポソームの電荷はマイナスと考えました。 マイナスのリポソームの中に、マイナスチャージが大きいDNA（pTT）を内封することができるのか？？と思いました。電荷の反発によって内封できるものなのですか？ 私の浅はかな知識では、負電荷のリポソームは、例えばDNAとPEIなどとcomplxを調製しプラスチャージにしてから静電的相互作用によって内封できるものかと思っていました。。。 同時に、細胞内導入する為にはカチオンが必要かと思っていましたが、リポソームはマイナスチャージなので、内封するものにプラスチャージが含まれていないと遺伝子導入できないのではないかと思い、DNA/＋チャージの複合体を形成しなくてどうやって遺伝子導入できるのだろうと思いました。 そもそもpTTはマイナスチャージが大きいためキャリアとしてリポソームに内封させたとintoroductionでは書かれてあるのですが、同じリポソームがマイナスチャージなら同じじゃないかと思ったんです。。 知識や考察に浅はかで申し訳ありませんが、ご教授願います

(無題) 削除/引用 No.1393-4 - 2013/01/31 (木) 07:01:11 - おお >[Re:3] えさんは書きました : > カチオニックリピッドでは？ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3260031/ ちょっと突っ込んで調べてみました、dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) combined with cholesterol 3 sulfate...とかかれていました。 DOPEはCationic liposomeのco-lipidsとして混ぜるもので、燐酸とアミン両方もってますね。コレステロールの方は硫酸がついてネガティブです。 なので従来のカチオニックリピッドによる導入と違いますね。 質問者さまはこの論文は正しくないという主張なのでしょうか?まあ実験事実なら入ると受け止めれるわけですけど。。。

(無題) 削除/引用 No.1393-3 - 2013/01/31 (木) 06:05:46 - え カチオニックリピッドでは？

(無題) 削除/引用 No.1393-2 - 2013/01/31 (木) 05:13:35 - おお おしめしになるリポそーむにかんしてかくにんしないで書いているのでまちがっているかもしれませんが、、、 リポそ-む内の空間の大きさが電荷の反発を無視できる位大きいのだと思います。 静電的コンプレックスとかかれていますが、電荷を中和した状態でりぽそーむに封入して導入するということでしょうか? わたしはその必要を感じませんけど。エレクトロポレーションは裸のままネガティブにチャージしたDNAを直接細胞内にほりこみますよね。

核酸のみの遺伝子導入 削除/引用 No.1393-1 - 2013/01/30 (水) 13:30:13 - はな 大変初歩的な質問失礼致します。 「Topical delivery of DNA oligonucleotide to induce p53 generation in the skin via thymidine dinucleotide (pTT)-encapsulated liposomal carrier」 という文献を読みました。 pTTはマイナスチャージであり、高い水溶性分子のためそのままでは細胞内導入できないためキャリアとしてリポソームを使ったとあるのですが、 pTTとプラスチャージとのcomplexを内封させている訳でもなく、そもそもリポソーム自体マイナスチャージなのに、内封させることは可能なのですか？ また、膜融合脂質を用いてはいますが、静電的complexを内封させなくても細胞内に入り遺伝子発現することは可能なのですか？

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