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(無題) 削除/引用 No.1397-29 - 2013/02/02 (土) 04:25:20 - おお >[Re:28] Qさんは書きました : > 質問を聞く方が、そこはチェックしてあるから考えなくてもいいってポイントはどこか？ > が、わからないと、大変だって言いたかっただけです。 まあ対話形式でやれば、見えてくるようになるし、そういうのでもいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1397-28 - 2013/02/01 (金) 10:34:31 - Q 消す消さないではなくて（そういう意図は全くないです）、 質問を聞く方としては、何が聞きたいのか？ 質問を聞く方が、そこはチェックしてあるから考えなくてもいいってポイントはどこか？ が、わからないと、大変だって言いたかっただけです。

(無題) 削除/引用 No.1397-27 - 2013/01/31 (木) 16:20:21 - KEN >>trizolさん >ご指摘の通りです。まず発言が不適切でした。板汚し失礼致しました。削除をお願いしようと思います。 RNAのクオリティーにこだわりすぎて、木を見て森を見ずな質問なのは否定しませんが、みなさん真剣に答えてくださっているのに、消さなくても。。。 経験積まないと、そういう失敗は多いですからねえ。 >nano drop自体がなくODの波形を見たことはありません 大学内の共用実験施設とかに置いているかもしれないので、可能なら借りて計測してみては？ >プライマー自体情報もあまり無しに渡されたもの、DNaseすらない。 プライマーは、Intron spanningで設計されているのでしょうか？そうでないなら、あなたの見ている増幅されたものは、ただのDNAからの増幅の可能性すらありますが。。。 また、ほかの方もご指摘されていますが、プライマーの劣化もあり得ます。 保存は、どのようにされていますか？TE希釈10uM程度で保存する場合、-30度ならば、数年余裕ですが、4度では半年くらいでPCRがWorkしにくくなるケースもあります。 >RT用の試薬や酵素も既に薄めたものしか実験室に置いてなく >ラボの基準プロトコルがSuperScript系を(酵素も)薄めてあります。 酵素を希釈して保存など、やめた方がいいです。ラボに分子生物学の専門の方はおられませんか？その方に相談の上、変更すべきかと。 また、業者のプロトコールよりもTaqはケチってもWorkすることは多いですが、RTは失敗しかねません。それをするくらいならば、RT-PCRの全量を10ul系に減らせば良いのではないかと。 PCRの条件は、現時点ではどのような方法になっていますか？ リアルタイムと同じ条件だと、酵素も異なると思いますので、かからない可能性も。。。3ステップサイクルで行っていますか？また、先輩の実験では通常のPCRでの最適な増幅条件を決定しているのでしょうか？ 伸長時間は、リアルタイム用なのであまり増幅長も長くないので、特に問題ないかと思いますが、アニーリング温度はグラディエントPCRするなりして、決定したほうが良いかと思います。 順番としては、RNA抽出条件の最適化よりも先に、すでに増幅に成功したPCR産物を用いて、PCRの条件の最適化を行うのが良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1397-26 - 2013/01/31 (木) 15:26:34 - おお そもそもその遺伝子3T3で発現しているの?それともアクチンとかをポジこんとしてrtpcrをやってだめだったってこと?3T3はマウス由来の細胞だけどプライまーはほかの働く系ではマウスの細胞?

(無題) 削除/引用 No.1397-25 - 2013/01/31 (木) 15:08:11 - AP >目安として例えばPCR10回分(2^10)の希釈倍率でも増幅できればokなどの基準はありますか？無学ですいません。 いや逆に、既知濃度の鋳型DNAの希釈列でPCRをかけてみて、どの程度の鋳型量まで検出できるかをまず見て、あなたのRT系でそれに見合うだけの標的cDNAができる見込みがあるだろうか、そうするにはどれくらいの出発材料でどのくらいの効率を達成したらいいだろうかと考えてみたら。

(無題) 削除/引用 No.1397-24 - 2013/01/31 (木) 14:28:03 - AP >またRNA量に従ってさらに減らすようになっています。 説明書にはこれはしてはいけないと、確か書いてあったと思ったが。 >cDNAの持ち込み量を減らした状態での内部コントロール増幅ということでしょうか？ 違います。問題のプライマーセットで予め増幅して単離したPCR産物かクローン化されたcDNAを鋳型にしてPCRしたら必ずうまくいくのかどうかということです。 問題がなければやはりRTまでのどこかに原因を求める方向でいいですが、そもそもちゃんとしたDNAを鋳型にしたPCRでも安定した結果がでないようであれば、何をかいわんやということです。

(無題) 削除/引用 No.1397-23 - 2013/01/31 (木) 14:08:20 - trizol ＞Qさん ご指摘の通りです。まず発言が不適切でした。板汚し失礼致しました。削除をお願いしようと思います。 ＞APさん cDNAの持ち込み量を減らした状態での内部コントロール増幅ということでしょうか？以前確認はしましたが、毎回はしていません。 目的遺伝子に関しては鋳型とできるサンプルが自分のもののみとなります。これは濃度を割り振って増幅していないのでまず試してみようと思います。目安として例えばPCR10回分(2^10)の希釈倍率でも増幅できればokなどの基準はありますか？無学ですいません。 あとAPさんの言うとおり、ラボの基準プロトコルがSuperScript系を(酵素も)薄めてあります。またRNA量に従ってさらに減らすようになっています。この点を改善して今までのRNAサンプルも見直してみます。ありがとうございます。 ＞おおさん 水に溶かした後のクロロフォルム、エタ沈。今までは水に溶かした後OD比が悪く回復できそうであればまたTrizolをしていましたが、それこそ無駄だったのですね。ありがとうございます。AGPC法から再度勉強しなおします。

(無題) 削除/引用 No.1397-22 - 2013/01/31 (木) 13:54:00 - AP 繰り返しになりますが、 >PCR産物あるいはcDNAクローンなどを使ってPCRをかけてみたとき、微量の鋳型でも難なく増幅するでしょうか。 こういう実験はやっていますか。他の方も指摘されていましたが、ただのPCRが上手く動いているかどうか、トラブルがある場合、トラブルシューティングとして、当然考える点ですよね。結果として、これには問題がないとなれば、問題点が絞れるてくるわけですし、やらない理由はないですよね。 先輩がやって大丈夫なだったプライマーだからチェックする必要ないというのはあまりに意識が低いと思います。同じロットだとしても経時劣化していて、また同じ配列だけれど別ロットなら品質が劣っていて、あるいは単にあなたの手が悪いために、PCRがかかりにくいということもあるかもしれないじゃないですか。 言われたことだけやる、与えられたものだけでやるという意識では、この問題も、これから起こる問題も、なにも解決できないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1397-20 - 2013/01/31 (木) 13:40:45 - AP >RT用の試薬や酵素も既に薄めたものしか実験室に置いてなく、 どういうことなのか理解しがたいですが、酵素などは希釈すると不安定になるので、予め希釈して保存してあるというのなら、そのシステムやめたほうがいいです。 また、メーカーのプロトコールだとRT反応は、たとえば20 uLにRTase 1 uL使ったときに投入できるRNA量は1 ng〜3 ugのようにかなり幅広くなってないですか（物によって違うかもしれませんが）？　ただ、投入するRNA量が多くなるほど、逆転写効率は下がるし、完全長のcDNAも増えてきます。何がなんでも量を追求するのではなく質を優先する実験なら、かえってRNA量を減らしたほうが良い場合がおおいです。1 ug用のシステムだからといって1 ug入れなかればならないというものではなく、そこに質のよいRNAを少量いれるというのも見識です。 また投入するRNA量を減らすのだからと言って、酵素量を減らしたりするとうまくいきません（少なくともSuperscript系のRTaseは）。

(無題) 削除/引用 No.1397-19 - 2013/01/31 (木) 13:33:31 - おお TRIZOLの場合はguanidine thiocyanateやフェノールのキャリーオーバーが問題になる可能性があるので、得られたRNAを水に解かしたあといちどクロロフォルム、エタチンすればかなり改善する可能性はなきにしもあらずです

(無題) 削除/引用 No.1397-18 - 2013/01/31 (木) 13:29:24 - おお >[Re:17] trizolさんは書きました : > > クオリティーが問題ならNP-40→mRNA調整もありかなと思ったのですが24ウェルでも普通にいけますか？ 分解に対して余計に難しい状態になるので、クオリティーがさがるとおもいます。mRNAをちょうせいするならTRIZOLのような試薬で調せいした後でもつかえますし、まあ収量が10ngとかになりそうですし、ステップも増えてチェックポイントもふえるし大丈夫かなぁというきがしますけど。rtの効率は上がるかもしれませんが、インプットのりょう (コピー数)は同じ24ウェルからとったのだからかわりがないか、おそらくへるでしょうし。TRIZOLのようなやつで、サイトゾルだけのRNAが採れるとうたい文句の試薬があったような気がしますが、たしかインビトロジェンからでてたと、そう言うの試すことができるかわかりませんけど、、、 rtを薄めた試薬というのがどう薄めたか気になるのですが、それでかなり効率を落としているのではないかと勘ぐったりしています。

(無題) 削除/引用 No.1397-17 - 2013/01/31 (木) 12:38:53 - trizol 沢山のレスありがとうございます。 ＞nano dropの波形 nano drop自体がなくODの波形を見たことはありません。純度と言っているのは、単に目安のOD比(TE溶解)です。たまたまなのか目的遺伝子の増幅が上手く行った時のデータはすべて(細胞種別気にしなければ10例ほど)目安のOD比が1.95ほどだったので、それでちょっとこだわりすぎているかもしれません。 ＞Primerの増幅効率 プライマー自体情報もあまり無しに渡されたものなのですが、リアルタイム用のモノをRT-PCRに使っています。結果が出ればそれでリアルタイムをする。先輩のリアルタイムデータがあるはずなので、増幅効率を見てみます。ただ、プライマーについてはGapdhなどの内部コントロールが出るのに目的遺伝子が出ないので検討してみたい旨以前伝えたところ、研究室の先輩が以前それで結果出してるからプライマーはそれでいいとの話だったので期待できないかと思います。 ＞genとる君 新しいものを買うのは無理そうですが、共沈にはいままで消極的だったのでグリコで積極的に試してみます。 RNase inhibitorやDNaseは当然無いです。One Step PCR自体が無く、two stepのTaqのみだったと思います。 1ugギリギリと書いたのは、RT用の試薬や酵素も既に薄めたものしか実験室に置いてなく、マニュアル上1pgからいけると言われてもラボでは皆1ugで運営されていて、自分も大体は0.5ugをテンプレートにしています(in vitroは私だけです)。 クオリティーが問題ならNP-40→mRNA調整もありかなと思ったのですが24ウェルでも普通にいけますか？

(無題) 削除/引用 No.1397-16 - 2013/01/31 (木) 10:29:13 - Q ぶっちゃけていいですか？ 質問が長いし、途中でいらないと思われる物語が入ったりで 何が問題なのかよくわからないです。 要するにRT-PCRがうまくいかないってことですよね？ それで、どうしてRNAの純度だけを問題としていそうですが、 それもよくわからないです。 RT-PCRは多くのステップがあるでしょう？ どこが駄目なのかをきちんと検証していなさそうなのに、 どうしてRNAの純度だけを言っているの？ もうちょっと、やってわかっていること それから導かれる問題だと思われる点に アドバイスがもらえるようにしないと 途方も無いです。

(無題) 削除/引用 No.1397-15 - 2013/01/31 (木) 10:20:14 - AP ふつうngオーダーあるならアルコール沈殿の回収率は悪くありません。ましてや、１ugに届くほどあるなら共沈剤は、目視しやすくするという瑣末なメリットのほかはあまり意味が無いでしょう。 微量な核酸を抽出するとき、相分離での分配によるロスや器具などへの吸着ロスを防ぐため、yeast tRNAやpoly I.CのようなRNAをキャリアとして共存させるというのは効果があります。しかし、それほど微量というわけではないですよね。 RT-PCRのときにサンプル毎に効率の差が振れやすいのは逆転写です。逆転写酵素は鋳型利用効率や伸長性があまり高くなく、oligo-dTやgene-specific primerでプライミングした時で、良くて鋳型RNAにたいして20%くらい、random primerで50%くらい、しかもRNAの純度等によって影響を受け易いです。 最近はより性能の高い逆転写酵素がいろいろ出ているので、酵素を変えてみるのもいいのではないでしょうか。効果があるかわからない段階でいろいろ購入することは出来ないでしょうが、メーカーにサンプルを供出してもらうことはできましょう。 また、おそらくprimingはrandomだと思いますが、もしoligo dTなどでしたらrandomに変えるだけで効率がぐっとあがります。 また、PCRはプライマーの選び方によって増幅の難度がかなり影響を受けます。 PCR産物あるいはcDNAクローンなどを使ってPCRをかけてみたとき、微量の鋳型でも難なく増幅するでしょうか。そうでないなら、プライマーのデザインを変えてみるとブレークスルー出来るかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1397-14 - 2013/01/31 (木) 10:11:21 - まっくろん 　私もおおさんがおっしゃるような，Trizol/クロロフォルムを2回やってました。OD比に関して言えば，その方が私のところでは好成績（2に近づく）が出てました。 　あと，水相の回収量を向上させるためには，キアゲンのMaxtractチューブを使ってました。遠心分離すると水相と有機相の間にロウみたいなやつの層入って，きれいに取れるというやつです。節約ラボとのことですので，採用されるかは分かりませんが，水相回収はデカンタでいいくらい楽です。

(無題) 削除/引用 No.1397-13 - 2013/01/31 (木) 09:54:57 - おお そうですね。わたしもウェルあたりの収量はほかの細胞より低くてもおかしくない気がします。なので収量が低い=精製がうまくいってないとは言えませんね。

(無題) 削除/引用 No.1397-12 - 2013/01/31 (木) 09:24:32 - qq NIH3T3は、およそswiss3T3と同じような細胞動態だと思うのですが、3T3は、他の培養細胞（293やCHO、HepG2など）に比べると、圧倒的に細胞数が少なく、細胞がフラットで、接触阻害がかかってギチギチになりにくいと思うのです。 ですから、24ウェルで他の細胞のRNAが十分とれたとしても、3T3では細胞数が足りないということがあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1397-11 - 2013/01/31 (木) 09:20:01 - おお 日本ジーンもだしてるよね。ISOGENだったっけ。値段はご自分でご確認ください。

(無題) 削除/引用 No.1397-10 - 2013/01/31 (木) 09:10:08 - TS Trizolけちっているとは、どの程度ですか? 1ウェルで50〜100μLとか？ 内容には直接関係ないですが、同類の試薬でTrizolより安いのもあると思うんだけど。わたしは、SigmaのTrireagent使っています。Trizolより2割くらい安いですね。

(無題) 削除/引用 No.1397-9 - 2013/01/31 (木) 08:46:26 - おお >[Re:8] KENさんは書きました : > 一応、TRIZOLの自作プロトコール > > http://www.my-whiteboard.com/homemade-trizol-protocol-for-isolating-rna-from-culture-cells/ > > ただでさえ、抽出が失敗している現状で、自作TRIZOLを使うのはやめたほうがいいでしょうけど。ｗｗｗ たしかにそれはいえてますね。。。まあスケールを大きくできるならクオリティーの検証もしやすくなるでしょうし。。。

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