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リアルタイムPCR用マスターミックスの調整の仕方 トピック削除
No.1405-TOPIC - 2013/02/01 (金) 18:16:18 - みみ
タイトルの内容について質問させて下さい。

私は通常、リアルタイムPCRのマスターミックスを調整する際、全ての内容物を含んだマスターミックスを作成して、それを分注しています。
具体的に述べますと。例えば、technical replicatesをtriplicateにした場合ですが、

#1:まず、SYBR-green+水+cDNAのマスターミックス1を調整します。
#2:次に、マスターミックス1を使用するプライマー数だけ分注します。使用するプライマーが4種類(A、B、C、GAPDH)なら、4つに分注して、それぞれにプライマーを加えます。これをマスターミックス2とします。
#3:最後に、4つのマスターミックス2をそれぞれ(triplicateなので)3つのwellに分注し、リアルタイムPCRマシーンにかけます。

プライマーではなく、cDNAを含むマスターミックス1を調整する理由ですが、リアルタイムPCRの場合、最後にGAPDH等のインターナルコントロールでノーマライズするためには、A、B、C、GAPDHのPCR溶液それぞれに含まれるcDNAの量ができるだけ等しくなければならないと考えるからです。逆に、プライマーの量は若干誤差が出たとしても、cDNAに対して元々十分量添加されているはずなので、結果に差が出にくいと判断しました。

しかし、ここである人にこう言われました。
普通は、
#1:まず、SYBR-green+水+プライマーのマスターミックス1を調整します。使用するプライマーが4種類なら、4つ。
#2:そのマスターミックス1を(triplicateなので)3つのwellに分注します。
#3:最後に、その上から、cDNAを3つのwellに一発ずつ足していき、リアルタイムPCRマシーンにかけます。
だよ、と。

両者の違いは、
1、私がcDNAのマスターミックス1を調整するのに対し、ある人はプライマーのマスターミックス1を調整する。
2、私がマスターミックス2を調整し、各wellへのピペッティングを1回で済ますのに対し、ある人はマスターミックス2はスキップしてwellに分注してしまう。そしてその結果、cDNAを追加で1wellずつ足して行く。
の2点です。

ある人の方法だと、各wellへのピペッティングが2回になり、各well間の誤差がより大きくなるではないか、と主張したところ、
それが本当の誤差なのだ。ピペッティングを1回にするのなら3wellとも全く同じ内容になるのだから(実際は必ず結果に誤差が出てきますが)、そもそもtriplicateをする必要はない、と反論されました。
確かに、オンラインでプロトコルを検索すると、ある人の調整法ばかりがヒットしてきました。

私の調整法には、なにか問題があるでしょうか?それとも、どちらの調整法でも、問題はないのでしょうか?
リアルタイムPCRに詳しい方、ご存じの方、御教授よろしくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.1405-26 - 2013/02/04 (月) 19:17:29 - KEN
>Rさん、in situさん
ありがとうございます。

>得られるCt値は整数ではない。
たしかに、おっしゃるとおりで、自分も実際に論文を書く時は、そんなこと気にせず得られたCt値からコピー数を書いておりますが、今回の質問を見て、果たして精度的にどうなんだろう。。。と改めて思った次第です。

業者の説明書にも、2倍の差は見れるとは書いていますが、それ以上どこまでの精度で見れるかは私もきちんとは計算したことはありません。ウェル間でのばらつきは、タカラのデータでは、標準偏差=0.0931, 変動係数(CV)=0.39%のようです。

デジタルPCRですと、1.1倍の希釈系列を±10%の誤差で測定というカタログは見たことはありますので、リアルタイムは、それ以下の精度とは思いますけどね。

>測定誤差があることとその値が使えないことはイコールではないです。
>測定誤差があるからreplicateを取って、その平均を取ることで真の値に近づけようとします。

おっしゃるとおりですね。

試しに全量20ul, cDNA 2ul系でピペッティングの誤差に関しても調べなおしてみましたが、
【cDNA後入れ】
ピペットマンのP2を2ul入れるために使用 1ウェルにつき± 0.030 µLの精度。

【cDNA入りマスターミックス】
流石にきっかり3検体分のマスターミックスだと誤差が生じるので、4検体分作ると仮定して、8ulのcDNAをマスターミックスに入れる必要がある。
P-10のピペットを使うと仮定して、±0.09ul程度の誤差。
20ul系列で実験を行うと仮定して、マスターミックス80ulを20ulずつウェルにP-20で入れるとすると± 0.20 µLの精度(cDNAは±0.02ul?)。
cDNAでは、1ウェルあたりP-10の±0.09ul/4 & P-20の±0.02ulの誤差


これを多いととるか、少ないかととるかの判断で、みみさんの方法をとるか、後者の方法をとるかでしょうね。
N数にもよるでしょうね。この誤差がどの程度影響するかは、分かりませんが。。。
どっちも間違いではないと私は思います。

少なくとも言えることは、1ul系で後者の方法を用いて同じことを行うとかなりばらつくということですかね。

最後に、計算して改めて気づいたのですが、1検体1プライマーあたり、1ウェル分、マスターミックスが無駄になるのでちょっともったい気もします。(笑

(無題) 削除/引用
No.1405-25 - 2013/02/04 (月) 17:32:23 - in+situ
KENさん


確かに、「1.2倍の差をqPCRで検出しました(n=3)」とか言われたら、僕も疑いますね。

でも、それはqPCRの問題だけではなくて、それまでにRNA抽出、逆転写といった実験操作が入ってきているのでその影響も大きいと思います。

経験から想定される誤差は、n=3では1.2倍の増加が有意になるレベルではないくらい大きいです。

ただ、測定誤差があることとその値が使えないことはイコールではないです。

測定誤差があるからreplicateを取って、その平均を取ることで真の値に近づけようとします。

(無題) 削除/引用
No.1405-24 - 2013/02/04 (月) 17:29:07 - R
>1サイクルの検出の違いで、2倍量の差が検出出来るのが僂tですよね?

仮に1サイクルで2倍に増える増幅効率であれば、
例として、デルタCtが1であれば2倍の差になるね
ということかと。

"指数関数的に蛍光が増加している領域"において、
second derivativeなりfit pointにてCt値を算出するので、
得られるCt値は整数ではないですよね。

だからといって、精度が2倍の差以下を見られる精度なのかは分かりませんが。
検量線引いたときの相関係数と誤差から精度は見積もれるのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.1405-23 - 2013/02/04 (月) 16:23:05 - KEN
>in situさん

ちょっと、混乱してきてしまったので、教えてください。

1サイクルの検出の違いで、2倍量の差が検出出来るのが僂tですよね?
Ctの違いが1以下の場合の精度は当てにならないという業者の話を聞いたことがあったもので。。。
試薬によっては、もう少し精度が良いのはありますが。。。

例えば、
1500コピーのCt値が28ならば、750コピーのCt値が29。
たしかに原理的には、1000コピーのCt値は28~29の間には来ますが、上記の論理で当てはめると、これは測定精度的に問題あるんじゃないかなと思ったりしているのです。実際、そういう論文は多いですけどね。

だんだん、混乱してきているので、おかしいところに気づいていない可能性が大です。

気づかれた方は、ご教授いただけないでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.1405-22 - 2013/02/04 (月) 14:23:35 - in situ
ちょっと本論に関係ありませんが、

>リアルタイムの検出精度って、2倍の濃度差を区別出来るレベルですよね?

は少し違います。

1コピーと2コピーならば確かにその理屈になりますが、例えば1000コピーと1100コピーの差は2倍ありませんがちゃんとCt値の差という形に(理論上)現れてきます。

(無題) 削除/引用
No.1405-21 - 2013/02/04 (月) 13:44:22 - KEN
>その上で。この、きっちりcDNAの量を揃えるのに最も誤差が少ないのが、最初にcDNAのマスターミックス1を調製するやりかたなのかな

まだ、その前に、もっと重要なのは、内因性コントロールに何を使うのかということかと思います。
内因性コントロールの発現は全ての検体で等しいという前提の元で行なっている実験ですが、GAPDH, βactin, TBPどれも組織によって発現量も異なりますし、サンプルごとに等しいとはあくまで仮定なわけで、厳密には異なるかと。。。

また、マスターミックスの作り方で、果たして、現状のリアルタイムで果たしてその精度が良くなるのかは、ちょっと疑問です。

リアルタイムの検出精度って、2倍の濃度差を区別出来るレベルですよね?
いくら、薄いcDNAを使っているにしても、ピペッティングだけでそれだけの差が生じることはないのではと思います。
自分のピペッティングを、時々ピペットの精度検査の時にチェックしていますが、一定ですし。。。

デジタルPCRならば、その精度が必要だったりすると今後、言われるようになるかもしれませんけどね。

リアルタイムPCR用マスターミックスの調整の仕方 削除/引用
No.1405-20 - 2013/02/04 (月) 12:08:59 - みみ
R様、KEN様、本当に何度もご意見有難い次第です。
>遺伝子Xの発現量とGAPDHの発現量を比べることは、real-time PCRではできません。
全くその通りだと思います。例えば遺伝子Xのプライマーセットを2つ作成した場合、cDNAに含まれる遺伝子Xの量が同じでも増幅結果が異なってきます。ゆえに、同じプライマーセットを用いて、サンプル間の遺伝子量の差を測る。さらに、同じcDNA量を用いたGAPDHのPCRによって、最後にサンプル間のcDNAの量を均一化する。

また、多くの論文中のreal time PCRのfigureで、internal control(GAPDH、Beta-actin)に対するrelative expressionを縦軸に取ったグラフが用いられ、それが受け入れられていますが、もちろん遺伝子X/GAPDHの値そのものには全く何の意味も無く、それをサンプル間で比較した場合に初めて意味が出てくる。

と言うところまでは、共通認識で良いのではないかと思います。

ただ、上で
>さらに、同じcDNA量を用いたGAPDHのPCRによって、最後にサンプル間のcDNAの量を均一化する。
こう書きましたが、ΔΔCtの式的には、遺伝子XのwellのcDNA量と、GAPDHのwellのcDNA量が同じでなくとも良い。それよりも、サンプルAのGAPDHのwellのcDNA量と、サンプルBのGAPDHのwellのcDNA量が同じでなくてはならない。
極端な話、サンプルAのGAPDHのwellのcDNA量が遺伝子XのwellのcDNA量の2.0倍添加されたとしても、同じくサンプルBでも、GAPDHのwellのcDNA量を遺伝子XのwellのcDNA量のきっちり2.0倍添加すれば良い、と。

その上で。この、きっちりcDNAの量を揃えるのに最も誤差が少ないのが、最初にcDNAのマスターミックス1を調製するやりかたなのかな、と考えている次第です。

(無題) 削除/引用
No.1405-19 - 2013/02/03 (日) 23:21:07 - KEN
>Rさん
厳密にはおっしゃるとおりかと思いますよ。
というわけで、私は、刧僂tを行う前は、増幅効率等、前提条件はチェックしています。
(そうじゃないと、後からレビュアーに突っ込まれたら嫌なので。。。)

>areさん
>遺伝子によってアニール温度が違うから、同時にはリアルタイムを実施できなという事は無視されるのでしょうね(?)
私は、その場合、プライマー設計の失敗として設計し直します。
基本的には、全てのプライマーがアニーリング温度60度で実験できるように設計します。
(内因性コントロールと目的遺伝子が違うプレート上だと、ABIのソフトでは自動で計算出来ないから面倒ですし、ライフテクノロジーズの技術担当の方も違うプレートで行うのは、非推奨と仰っていましたから。)

(無題) 削除/引用
No.1405-18 - 2013/02/03 (日) 21:57:41 - R
>サンプルA,B間の遺伝子Xの発現量を比較するには、「|」と「==」が両方とも同じ実験条件でなければいけませんが、

「= =」が同じ条件になることはあり得ません。
遺伝子Xの発現量とGAPDHの発現量を比べることは、real-time PCRではできません。
(なので、「= =」を同じ条件になるように必要以上に努力する意味がわからないのです)

PCRの系で言えるのは、
遺伝子XはサンプルA, B間にどれだけの差があるか、
GAPDHはサンプルA, B間にどれだけの差があるか、です。

絶対定量せずに、直接、サンプルAの遺伝子X/GAPDHの比が得られるように記載しているメーカーもあるようですが、
それは増幅効率の違いを無視して計算式を書いたら、
そのような式に変形できるというだけだと理解しています。

何度も同じことを書いている気がしてきました、すみません。
テクニカルな誤差云々の前に、実験原理についての考え方の違いの方が大きいです。

ただ、私の意見は少数派なんだろうなとは思いました、、、

(無題) 削除/引用
No.1405-17 - 2013/02/03 (日) 19:10:28 - are
遺伝子によってアニール温度が違うから、同時にはリアルタイムを実施できなという事は無視されるのでしょうね(?)

リアルタイムPCR用マスターミックスの調整の仕方 削除/引用
No.1405-16 - 2013/02/03 (日) 17:12:50 - みみ
皆様ご指導ありがとうございます。(R様、直樹様、追加でのご意見ありがとうございました。)

R様
>technicalreplicateの誤差を小さく表示させることより、サンプル間の実験条件を揃えることの方が大事だと思います。
概念図を以下に図示しますと(うまく表示されれば良いのですが)、

サンプルA:遺伝子X == GAPDH
       |       |
サンプルB:遺伝子X == GAPDH

サンプルA,B間の遺伝子Xの発現量を比較するには、「|」と「==」が両方とも同じ実験条件でなければいけませんが、「|」を揃えるよりも、「==」を揃える方が相対的に難しいので(プライマーの誤差よりも、cDNAの誤差が結果に与える影響の方が大きいので)、cDNA毎のマスターミックス1を調製するやり方の方が、最終的なテクニカルな誤差(ピペッティングに依るブレ)を抑えられるのではないか、と言うのが主張なのです。もちろん、(直樹様の表にあるように)SYBRの量も誤差が出るのですが、マスターミックス1の液量自体が大きいので、その誤差は最小限にできると思います。
ただ、R様のように、最後にwellに添加するcDNAの量を5uL程度にするのなら、確かにピペッティングのブレは相当小さく出来ると思います。

>KEN様
私の場合は、1つ2つの遺伝子だけを見るという場合が少ない&細胞株を用いた実験系で比較的cDNAに余裕がある(貴重なonly one shotでは無い)、ので、「より正確にするため」と信じ込み、多少チューブを多目に使わせてもらっています。ただ、例えば60検体x2遺伝子の場合は現実性を考えて、ある人のやり方を用いると思います。検体が多い場合はプライマーのマスターミックスを、遺伝子数が多い場合はcDNAのマスターミックスを調製すればいいじゃん、というのが現実的かも知れません。

>有意差ないのにあるように化けてしまうような大きな誤差は、どちらの方法でも起きないと思いますが。。。
確かにそうですよね。こちらのトピックに寄せて頂いた6人の皆さんの中でも、3対3?ですから、どちらのやり方も問題ないと言うことでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.1405-15 - 2013/02/02 (土) 23:05:50 - R
デルタCtについて、下記の論文に基づいて
Pfaffl, M.W. (Nucleic Acids Res 29;2002-2007, 2001)
>デルタCtとは、サンプル間のデルタCtではないでしょうか。

と記載しましたが、

ABIのLivak, K.J. and Schmittgen, T.D. (Methods 25;402-408, 2001)では、
デルタCtはtarget geneとref geneのデルタCtですね。
(こちらは増幅が常に1サイクルで2倍と仮定するのが前提)

私は、最初の論文の方が考え方がよく理解できると思うのですが、、、
PCRにおいて、プライマーの違う系を単純に比較するのは、よほど条件検討していない限り、受け容れがたいです。

テクニカルな話では、
私は検量線も作成するし、
プライマーは1 uLずつ2つ分注、
cDNAは5 uLずつ分注にしているので、
cDNA以外でマスターミックスにしています。

(無題) 削除/引用
No.1405-14 - 2013/02/02 (土) 17:49:15 - KEN
逆に質問ですが、みみさんの方法で大量検体を行うと、チューブが増えすぎて、時間がかかるだけでなく、コンタミのリスク、サンプル取り違いのリスクがあると思いますが、その点は、どのように工夫されているのでしょうか?

また、低濃度のcDNAだった場合、チューブの移し替えが多いと、チューブへの吸着が発生するリスクもありますが、特に問題にならないのでしょうか。
(SYBR系を用いている時点で、高サイクルでは、ダイマーが出てきてしまうので、低濃度までは検出しないという前提なのかもしれませんが。。。)

例1
検体数が60検体。プライマー2つ。という条件下で行う場合。
【みみさんの方法】
60個のcDNAサンプルチューブ。
60個のcDNA入りマスターミックス。2つずつに分注するので計60+60x2個のチューブ。
【後者の方法】
60個のcDNAサンプルチューブ。
2種類のプライマー入りマスタミックスチューブ。あとは、直接分注するので必要なし。60+2個のチューブが必要。

逆に検体数が2検体。プライマーが60種類という条件でも同じことが発生するので省略。


自分の扱っている検体は、人間の身体にも一般的に不顕性感染していて、身体をぬぐったものだけでウイルスDNAが検出出来てしまうので、チューブの開閉回数が増えるといくら手袋をしているとは言え、とてもヒヤヒヤしてしまいます。
ですから、邪道かもしれませんが、マスターミックスのウェルへの分注は連続分注器も使っています。
ちなみに私は、主に後者の方法&絶対定量法&TaqMan法で行なっています。

両者の方法とも、生データの値でそのまま発現量が多い少ないと言ったら大問題でしょうけど、結局のところ、統計処理をしますよね?
両者とも誤差は全ての検体に対して、全てに等しく発生しうる条件ですし、これで有意差があれば特に問題にならないのでは?
ウェル間誤差といっても、ピペッティングする人間の腕によるところが大きいでしょうが、自分は、値がそろって、ほぼないことが多いですよ。
有意差ないのにあるように化けてしまうような大きな誤差は、どちらの方法でも起きないと思いますが。。。

(無題) 削除/引用
No.1405-13 - 2013/02/02 (土) 16:41:27 - 直輝
「同じcDNA中に含まれる目的遺伝子と、内在コントロール遺伝子」の比較に影響が少ない誤差を()に入れると…

みみさんのやり方
#1...(SYBR green分注誤差)、(水分注誤差)、(cDNA分注誤差)
#2...マスターミックス1分注誤差、(プライマー分注誤差)
#3...マスターミックス2分注誤差

ある人のやり方
#1...SYBR green分注誤差、(水分注誤差)、(プライマー分注誤差)
#2...マスターミックス1分注誤差
#3...cDNA分注誤差

こうなるのかな?
これだとみみさんのやり方の方が良いように思えてきた。

※プライマーは十分あるから多少濃度に誤差があっても問題なくて、cDNA量とSYBRの量が特に重要という考え方で書いてます。

(無題) 削除/引用
No.1405-11 - 2013/02/02 (土) 15:50:03 - ねずみ
私はmi1さんに同意です。

> 真に比較するのは同じcDNA中に含まれる目的遺伝子と、内在コントロール遺伝子ではないでしょうか。

これが最も重要なポイントだと私は思っています。
通常リアルタイムPCRは相対値としてデータを出すと思います。その際基準となるのは内在コントロールであり、内在コントロールと目的遺伝子の間でテンプレートDNA量になるべく差が出ない方法で実験を行うことが正確な値を出すために必須なのではないでしょうか。1チューブ(or 1ウェル)で内在コントロールと目的遺伝子を検出する方法もありますが今回は違うようですので。

考え方として間違っているでしょうか。私も詳しい方のご意見を伺いたいです。

(無題) 削除/引用
No.1405-10 - 2013/02/02 (土) 15:28:24 - 直輝
ピペッティング誤差の発生箇所ですけど、

みみさんのやり方
#1...SYBR green分注誤差、水分注誤差、cDNA分注誤差
#2...マスターミックス1分注誤差、プライマー分注誤差
#3...マスターミックス2分注誤差
ピペッティング誤差は上記6回発生していますが、Triplicateで評価できるのは最後のマスターミックス2分注誤差だけですよね。

ある人のやり方
#1...SYBR green分注誤差、水分注誤差、プライマー分注誤差
#2...マスターミックス1分注誤差
#3...cDNA分注誤差
ピペッティング誤差は上記5回発生していますが、Triplicateで評価できるのはマスターミックス1分注誤差とcDNA分注誤差ですよね。

みみさんのやり方だと、誤差が6回発生していてTriplicateでは最後の1回の誤差しか見る事ができない。
ある人のやり方だと、誤差が5回発生してTriplicateでは最後の2回の誤差を見る事ができる。

誤差の発生回数が少ない上に、Triplicateでより多くの誤差をカバーできるのだから、後者の方が優れていると考えます。


何か考え落ちがあったらゴメンなさい。そして教えてください。

(無題) 削除/引用
No.1405-9 - 2013/02/02 (土) 14:56:28 - mi1
私はみみさんとだいたい同じ考えでやっています。
見たい誤差は機器のアウトプットの誤差であって、回避できる分注誤差は回避すればいいと思っています。また、cDNA量の誤差をキャンセルするためにノーマライズするわけで、わざわざcDNAの分注誤差を加えるのは意味不明な操作のように感じます。真に比較するのは同じcDNA中に含まれる目的遺伝子と、内在コントロール遺伝子ではないでしょうか。

正直悩むところで自信はないので、本当のプロの意見が伺えるとよいのですが。

(無題) 削除/引用
No.1405-8 - 2013/02/02 (土) 14:52:06 - R
>マスターミックス1を同時に調製するので揃えることができます

それをサンプル毎にまず分注して、さらにプライマー毎に分注するのですよね。

>どちらの調製法が、よりテクニカルなブレを回避できるか

みみ様のやり方は、単にサンプル毎の分注による誤差を"見ないこと"にして、誤差を小さく見積もっているように感じるのですが。

>私の認識では、triplicateで検出できるのは、最後に3つのwellに分注する際のピペッティング操作の誤差(微妙な量の違い)のみです。

それで、サンプル毎のプライマー分注の誤差を見ることに意義があるのでしょうか?
(プライマー量の誤差が実験系に与える影響が小さいとわかっているのに)

>デルタCtの大前提は「同量のcDNA」にあると思うのですが

デルタCtとは、サンプル間のデルタCtではないでしょうか。
(式を見てくださいましたか?)
プライマー間のデルタCtは増幅効率の違いのため、厳密にはダメです。
(増幅効率をどれも1サイクルで2倍と"仮定"した式ではなく、元の式を見て考えてみてください)

technicalreplicateの誤差を小さく表示させることより、
サンプル間の実験条件を揃えることの方が大事だと思います。

リアルタイムPCR用マスターミックスの調整の仕方 削除/引用
No.1405-7 - 2013/02/02 (土) 01:31:51 - みみ
皆様、貴重なご意見をありがとうございます。

直樹様
誤差の反映に関してですが、私の認識を述べさせて下さい。
私の認識では、triplicateで検出できるのは、最後に3つのwellに分注する際のピペッティング操作の誤差(微妙な量の違い)のみです。
私の調製法でも、ある人の調製法でも、マスターミックス1を調製する際の誤差は、3つのwellには反映されません。
この点は両者ともイーブンな条件だと思います。
その上で。ある人の調製法では、最後に3つのwellに分注する際のピペッティング操作が2回になり、わざわざ誤差を無駄に蓄積していることにならないでしょうか?

R様
>比較したいもの以外を、できるだけ揃えるように考えます。
私も同意いたします。ただ、リアルタイムPCRの場合、同一サンプル(cDNA)内でまず、target geneとinternal controlの比較が必要なので、比較したいプライマー以外を、cDNAの量をできるだけ揃えるように考える、という結論になりませんか?
つまり、最後に1 wellずつcDNAを足してゆくある人の調製法では、target geneとinternal controlのwell間で同量のcDNAを入れたという保証が出来ないと思うのですが、どうでしょうか。デルタCtの大前提は「同量のcDNA」にあると思うのですが。

>「サンプルAとサンプルBは違う日に測定してもいいよね」となりかねません。
確かに私の調製法では、サンプルAとBは別々にマスターミックス1を調製しなければなりません。
ただ、質問文でも述べましたが、プライマー量の誤差よりもcDNA量の誤差のほうがPCRの結果に影響を与えるという点。このリスクは回避出来ます。
また、同様に結果に大きな影響を持つ、SYBR-greenの活性と、水の純度も、サンプルAとBのマスターミックス1を同時に調製するので揃えることができます。

要は、どちらの調製法が、よりテクニカルなブレを回避できるかという疑問に行き着くのですが。
引き続き、御教授よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用
No.1405-6 - 2013/02/01 (金) 23:20:31 - R
私は実験系をデザインする際には、
比較したいもの以外を、できるだけ揃えるように考えます。

real-time PCRの場合、cDNAを比較したいので、
マスターミックスはcDNA以外です。
(そして、cDNAの分注に誤差がないか見るためにtriplicateなりduplicateします)
(みみ様のやり方だとprimer分注の誤差を見ることになるので、replicateは私も意味がないと思います)

Target geneは"同一条件の中で"サンプルAとBで何サイクルの差がありました。
同様に、Ref geneは"同一条件の中で"サンプルAとBで何サイクル差が出るかを求めます。

デルダ・デルタCtの式は上記のようになっていませんか。
また、検量線を用いる場合でも同様に考えます。

みみ様の考え方だと、「サンプルAとサンプルBは違う日に測定してもいいよね」
となりかねません。
これは、違和感ありますよね。

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