>>外注先からピークが所々重なり、解析出来ない結果があります。
これは、800bpのどこら辺の位置でしょうか？
800bp全体的にわたってピークが重なっているのでしょうか？
また、配列は、ATリッチとか、繰り返し配列があるとか、その他特異的なものではないでしょうか？
また、出来たら、読めなかったサンプルの波形データの画像があると助かりますが。。
シークエンス反応のプライマーの濃度を変えたら、うまく行ったことと、PCR後サンプルの精製方法のグレードをあげたらうまくいったことならありますが。。。
>>シークエンスPrimerはPCRで使用しているF側を使っています。
配列内に、プライマーがくっつきそうな、配列は他にないでしょうか？
また、800bp程度のPCR産物をシークエンスしたいならば、FとR両側から行ったほうがよいのでは？読み始めがあまり綺麗に読めないのでは？
>>外注先に送った内容は
PCR産物 20ng, Primer 3.2pmpl
PCR産物は、どのような精製方法を行なっていますか？ゲル切り出しでしょうか？バンドが2本以上見られる場合は、マルチピークになってしまうことがあります。
>>結果が得られた時のRaw Dataのインテンシティは平均で1000位で、インジェクションタイムは4秒でした。
Raw Data 低すぎませんか？全くシークエンス反応が進まなかった時は、低いことも多いですが。。。600bp程度ですが、3000~10000くらい出ることもあります。Trace Scoreはいかがですか？1000くらいのSignal Intensityの時、だんだん後ろの方にしたがってどんどん低くなっていっていませんか？
>>他の理由が考えられるのか
同じ検体を送り直してうまく行ったと書いてあるので、ありうるのは、サンプルの劣化。シグナルもなんだか少し低い気がしますし。。。
凍結融解を何度も、繰り返したりはないでしょうか？
経験的には、3回程度はセーフでしたけど。
また、HIDI Formamideに溶かしたら、数日以内、溶かす前の乾燥状態ならば、−20度なら1ヶ月程度持つとは聞いたことがありますが、自分は精製後は、48時間以内には、機械にかけてしまいます。
>>読めない場合は、外注先に任せれば良いと割り切れれば良いのですが、
そうも言っていられないので環境
料金のことを気にされているなら、ラボや共用実験施設などのシークエンサーを使うというのはどうですか？
また、PCR産物＋プライマーをシークエンス反応せずに別々のチューブで送るセパレート型で最安値は、850円(多検体700円)からサービスがありますよ。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加