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(無題) 削除/引用 No.1408-9 - 2013/02/05 (火) 05:58:39 - おお まずは何とか抗体の特異せい(特異的バンドを同定)を見なければ、最後までどのサイズが本当なのか分からなくなりそうですね。 糖修飾は予測で有り得そうなものがありますか? 修飾を消化してペプチドの従来のサイズを見るというのはあり得ますが、それはちょっと先の話かもしれません(使えるサンプルしだいかと)。 ほかの方の指摘にもありますようにちいさいサイズではやはり予測されるサイズに対してぶれも大きくなるかもしれません。 低分子がスメアーになっているとのことですが、分離能がタンパク以外の物の影響で悪くなっているかもしれませんね。そうするとIPしてしまう方が有利かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1408-8 - 2013/02/05 (火) 04:01:30 - U 皆様、再度のコメントありがとうございます。 おおさん リコンビナントのタンパクがニトロセルロース膜のウエスタンで検出できたところで安心してしまい、実はIPまでやってしまったんです。ところが培養上清のIPサンプルでは5-10kDa辺りにまったくシグナルが出ないため、急遽ウエスタンの改善を検討することになりました。細胞のライセートでは、20-100kDaに結構ノンスペバンドが見られるのに、15kDaより下にはoverexposureでもまったくバンドがないため、transferの問題ではないかと疑っています。細胞のライセートをtransferしたニトロセルロース膜ではポンソーも見てみましたが、15kDaより下ではスメアを引いた感じになってました。このサイズのタンパク自体が少ないのか、transferの問題なのか、ゲルの方を染めてないのではっきりしません。 KENさん 購入するなら、MilliporeのImmobilon PSQにしようと思っているのですが、隣のラボにGEのPVDF膜（0.45micro）を使っている人がいたので、Immobilonを買う前にこちらを拝借して試してみる事にしました。 リコンビナントのタンパク（あまりこういう用途では使いたくなかったのですが）の希釈系列を作り、サンプルのSDSを終濃度で1.5%に下げ、SDS-freeのゲルを使って流した上で、PVDF膜 ２枚重ねでtransferしてみました（1.5mA/cm2、 45min、transfer bufferのメタノールは10%でSDS-free)。マーカーが結構２枚目の膜にもtransferされていて驚きました。今回はtransfer後のゲルも染めているので、明日には何が起きているか多少分かると思います。マーカーの抜け具合を見ると、Immobilon PSQを購入せざるを得ない感じです。 分泌あるいは細胞内タンパクの量については、mRNAを見る限り、そこそこはあると思っています。ウエスタンの予備実験で使ったリコンビナントのタンパクの方が多すぎた感じです。検出系の改善はバックグラウンドの増強との兼ね合いなので、PVDF膜を使った場合のバックグラウンドなど、もう少し試行錯誤した上で考えてみます。（というか、単にラボが金欠なので、新規の試薬の購入は最小限にしたいだけだったりもしますが。。。）

(無題) 削除/引用 No.1408-7 - 2013/02/04 (月) 03:56:08 - おお IPしてwbすると見れるかもしれませんね。 低分子の分解能は核酸や脂質が混じるとTRIS/TRICINEでも悪くなることがありますので細胞からのライせーとはちょっと要注意です。比較的多くあるサンプル、あるいは同様に処理した細胞や動物からのサンプルなどで、転写後ponceauなどで染めてえいどうがきれいにいっているかまず見てみるのも手かと思います。

(無題) 削除/引用 No.1408-6 - 2013/02/04 (月) 01:27:56 - KEN PVDF膜は、Milliporeならサイズ的に、イモビロン-PSQメンブレンとかでしょうかね。 自分は、普段は、イモビロン-Pメンブレンとポアサイズが20kDa以上のものを利用しています。PVDFの方が楽なので、NC膜はノーザンくらいにしか使っていません。 蛋白の量が少ないことが予測されるならば、検出系も改善しても良いかもしれません。(まあ、一度に色々触るとややこしくなるかもしれませんが) 各社、様々なECLの試薬を改善して出していますし、従来の化学発光に変わり、蛍光検出なんていうのも出てきていますし。(蛍光はイメージャーを持っていないので、試したことはないですけど)

(無題) 削除/引用 No.1408-5 - 2013/02/03 (日) 19:39:56 - U 皆様ありがとうございます。 おおさん サンプルは、患者腫瘍検体から分離したストローマ細胞（主に造血系細胞）で、分離細胞から抽出したタンパク、RNA、および２４時間無血清培養後の上清を用いています。腫瘍からの分泌タンパクではないため、ポジコンとして使えそうな細胞株が見当たりません。現在作成中の発現ベクターの系が動き出すまで待った方が良いかもしれません。今使っている抗体では、大きなサイズのところに非特異バンドがかなり見られるので、ELISAや免染は、少なくともこの抗体では無理っぽいです。 qqさん Tris/Tricine SDS-PAGE で流しているのですが、この系の経験がそれほどあるわけではないので、文献（Nat.Protocol 2006; 1(1): 16-22)の記載そのままでやっています。ゲルのSDSは0.1%になっており、尿素は入れてません。Tris/TricineでもゲルのSDSは完全に抜いた方がいいでしょうか？サンプルのSDS濃度についてはどうでしょうか？少なくとも培養上清サンプルはdetergent-freeなので、もう少しSDS濃度を下げれるような気もするのですが（プロトコールでは3%なので、これまではこの終濃度でやってました）。古いインスリンがラボのどこかにあったような気がするので、探してみます。 qうぇrちゅいおp＠さん おっしゃられる通り、泳動度についても問題で、実際どこに出るか分からないんです。リコンビナントのタンパク（海外の研究者からの供与）は酵母で産生されており、glycosylationされていないと思われるので、仮にきちんとSDSがついていたとしても、ヒトのenodogenousのタンパクが同じ泳動度を示すかは不明です（おそらくglycosylationにより大きめに出ると思われます）。現時点では、20kDa以上に出るバンドは「非特異」と見なしていますが、この数字に論理的な根拠はありません。最終的には過剰発現とノックダウンでの確認が必要です。とりあえず、0.2microのPVDFで一回やってみます。

(無題) 削除/引用 No.1408-4 - 2013/02/03 (日) 13:13:08 - qうぇrちゅいおp＠ ペプチド断片のシーケンンスとかで昔よく使われてた0.22μmのメンブレンがある。エドマン分解でのN末シーケンスが主目的なのでペプチドの保持の点では優れていると思う。ウェスタンもできるが、バックが高かった。 ６kだとギリギリかもしれない。ていうかそのくらい小さいペプチドだと、SDSの付き具合とかアミノ酸組成とかが移動度に与える影響がかなり出てくるので、分子量通りの位置にでてくるかどうかも分からないと思う。

(無題) 削除/引用 No.1408-3 - 2013/02/03 (日) 12:03:19 - qq ＞PVDF膜の孔径について、より小さいものを選ぶべきか否か。 メーカーはそういってますよね。 ＞トランスファーはウエットにすべきか否か。 まずは、セミドライで良いのではないでしょうか？ ＞その他、どのようなご意見でも、伺えると幸いです。 ゲルの濃度というか、6kDaだと低分子用のTricine-PAGEにする必要があると思うのですが、如何がでしょう？先端に泳動されたタンパクは、大量のSDSが共に泳動されているので、転写されても、うまく膜に保持されません。同じ理由で、ゲルを作るときにSDSを入れない方が良いと思います。 条件を探すときに、ウェスタンでなくとも仕方ありませんから、何か安いマーカーペプチド（insulinなんかどうだろ？）を泳動・転写できると良いですね。

(無題) 削除/引用 No.1408-2 - 2013/02/03 (日) 11:49:56 - おお まずアドバイスするとしたら、その貴重なサンプルはおいておいて、培養細胞や動物血清とかで検出条件を整えた上でやる方がいいとおもいます。 どんな蛋白か知らないものに、あれがいいこれがいいというアドバイスはいいにくいです。 ですがあえていいますとわたしは.2umを好んで使います。短いものではWETでもセミドライでもいいような気がします。なれた方法でやる方が無難ではないでしょうか。 免疫染色やELISAはお考えになってないですか?

低分子量たんぱく質のウエスタン 削除/引用 No.1408-1 - 2013/02/03 (日) 11:15:10 - U いつもお世話になっております。低分子量タンパク質のウエスタンでの検出について、教えてもらえませんでしょうか。 今回、低分子（シグナルペプチドを除くと59aa、おそよ6kDa）の分泌タンパク質を検出する必要に迫られ、とりあえずラボにある備品を用いて一回試してみました（ニトロセルロース膜を用いたセミドライのウエスタンです）が、まったく検出できません。このタンパクが検出可能なレベルでは分泌されていない可能性も否定できませんが、細胞内のmRNAレベルでは比較的容易に検出できる事から、ある程度はタンパク質も存在すると推測しています。細胞内タンパク質のサンプルでも検出できないので、ウエスタンそのものに問題がある可能性を考えています。精製したリコンビナントのタンパク質を流した場合には、この系（ニトロセルロース膜でのセミドライ）でも検出可能なので、低分子でもある程度はニトロセルロース膜に捕まっていると考えられますが、実際に分泌されているタンパク量は流したリコンビナントのタンパク量よりはずっと低いと思われ、ウエスタンの系を改善する必要があると考えています。 とりあえず、PVDF膜を購入しようと思うのですが、サンプル自体に限りがあり、またラボの経済的理由もあって、色々と条件を振った検討ができない状況です。そこで、下記の点について、皆様のご意見をお伺いできないかと思っている次第です。よろしくお願いします。 （１）PVDF膜の孔径について、より小さいものを選ぶべきか否か。 （２）トランスファーはウエットにすべきか否か。 （３）トランスファーバッファー中ののメタノールの割合 （４）その他、どのようなご意見でも、伺えると幸いです。

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