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polyT配列を含んだＰＣＲが増えにくいことはありますか？ トピック削除
No.1421-TOPIC - 2013/02/06 (水) 16:42:01 - at
プライマー、アニーリング温度を変えても(50,55,60度)
どうしても増えない領域があります.

TTTTTTと、Ｔの連続配列が目的の増幅したいところに多いのですが
（5,6,多いところでは20個くらい）
これが邪魔をしているということはありますか？

酵素はKOD plusを使っております。
長さは1kbpです。

どうぞよろしくお願いいたします。。。
　
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たくさんのお返事をありがとうございます！ 削除/引用
No.1421-7 - 2013/02/07 (木) 18:56:45 - at
遺伝子破壊を行いたいので
できれば領域を変えずに行えればと思います。

Ｔだけでなく近くに4個程度のＡの連続配列も見られます。
やはり難しい可能性もあるのですね。。。

プライマーの設計と酵素の変更、アニーリング温度を上げてみるのを
試してみたいと思います。

どうにか増えてくれればよいのですが。。。

(無題) 削除/引用
No.1421-6 - 2013/02/07 (木) 15:33:02 - KEN
ATリッチやGCリッチなど、偏りがあって難しそうだったりするときは、混ぜものするよりは、酵素を変えてしまうことが私は多いですね。
(増幅領域を変えれるならそっちを優先しますが。)

たとえば、一昨年あたりに発売になったTAKRAのTKS Gflexとか前に書いたTOYOBOのKOD FX Neoとか。

普段使いはTAKARA Ex Taqですが、酵素を変えるだけで随分と成功率が高くなる印象があります。(値段も高いですが。。。)

(無題) 削除/引用
No.1421-5 - 2013/02/06 (水) 19:52:21 - おお
GとTからなる配列はシーケンスで読みにくかったりしますし、polyAなんかも読むののトラブルになったりしますね。AのうらはTですから、そう言う配列はPCRでもトラブるのもとになりそうです。

シングルスとランドに親和性のある蛋白とかをPCR反応溶液にまぜて反応に不利な構造になるのを防ぐような事ができるというコンセプトでそう言うのを加えるという方法があったような気がしますが、最近はあまりやらないのかな、、、

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8118404

(無題) 削除/引用
No.1421-4 - 2013/02/06 (水) 18:56:44 - aji
Tの連続以外に、Aの連続も近くにあったりしませんか？
ATでのステム構造があると、かなり増やすのが難しい印象があります。GCのステムより難しいと個人的には感じていますが。
PCRで試したことはありませんが、ベタインいれるとか。

(無題) 削除/引用
No.1421-3 - 2013/02/06 (水) 17:36:44 - KEN
追記：
KOD FX Neoを使っていた時の経験ですが、逆にアニーリング温度を高くしたらバンドが出現したということがあります。
とは言っても、65度くらいでしたけど。
(2stepでやってしまえみたいな温度のことも多かったですが)

(無題) 削除/引用
No.1421-2 - 2013/02/06 (水) 17:30:50 - KEN
自分は、KODはKOD FX NeoとPlus Neoしか使ったことはありませんが。。。

プライマーの設計がTaqよりも65度以上のTm値、塩基数も25mer以上での設計を推奨されていますが、その点は大丈夫でしょうか？

邪魔をしているということは、考えられなくもないですね。
KOD FX Neoとかはサンプルがもらえたと思いますので、そっちで試してみても良いかもしれません。

polyT配列を含んだＰＣＲが増えにくいことはありますか？ 削除/引用
No.1421-1 - 2013/02/06 (水) 16:42:01 - at
プライマー、アニーリング温度を変えても(50,55,60度)
どうしても増えない領域があります.

TTTTTTと、Ｔの連続配列が目的の増幅したいところに多いのですが
（5,6,多いところでは20個くらい）
これが邪魔をしているということはありますか？

酵素はKOD plusを使っております。
長さは1kbpです。

どうぞよろしくお願いいたします。。。
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