頻出問題の一つで恐縮です。過去のトピック等で幾分勉強させて頂きました。
自作のウサギポリクロでIPを行っております。一過性発現させたターゲットタンパクは、RIPAバッファ中で充分な効率でIPされます。一方、エンドのタンパクが全くIPされて来ません。現状として、以下二つの課題があります。
（１）「この抗体はエンドのIPには使えない」と本当に結論できるのか？
（２）WBで見えているエンドのバンドは、本当に目的タンパクか？
（２）ですが、WB上でのサイズ（migrationに特徴あり）はもとより、cell lineや組織での発現パターン、細胞局在はある程度既存の報告と一致しております。あとはノックダウンによる裏付け作業を行いたいところなのですが、「RIPA等の比較的high stringentなバッファ中でもIPされるならば、（KDを行う前に）これがターゲットタンパクであることが保証される」と言われ、IPを試みている次第です。
そこで（１）なのですが、一過性発現タンパクをIPできることから、抗体がそもそもIPに使えない訳では無いと思っております。抗体作製にはtruncateの精製物を使用したこともあり、主にはエピトープの露出を疑っています。差し当たって、
・2% SDS, 95℃ 5min で変性させたlysateをIPに使用
・urea変性させたlysateをIPに使用
・1〜5 mM DTT添加で酸化防止
・o/nで抗原抗体反応
を見当しておりますが、同様の経験をお持ちの方がいらっしゃれば、実際の成功例をお聞かせ頂けないでしょうか？また些細な情報でも構いませんので、上記の検討における具体的な実験条件等についても御助言頂ければ光栄です。どうぞ宜しくお願い致します。
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