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(無題) 削除/引用 No.1435-15 - 2013/02/18 (月) 10:16:13 - おお そういえば、えいどう中の酸化をふせぐためにえいどうそうのバッファーに何か入れるっていうのをきいたことがあるなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.1435-14 - 2013/02/17 (日) 22:55:10 - U 着色マーカーさん コメントありがとうございます。仰られる通り、結局ウエスタンのリニアレンジの問題で、このタンパク（リコンビナント）の場合、リニアレンジが実際のサンプルで予測される量より高いところにあり、使いがたいという事になります。ウエスタンの場合、最終的なシグナルの強度に影響する要素が多すぎて、コントロールできません。 まさに「ドットブロットで勝負できるかどうか」、言い換えると「ドットブロットでのシグナルが目的タンパクに特異的かどうか」が、今後の焦点です。IPがどうもワークしていないようなので、もし特異性が確認できなければ、培養上清を濃縮してウエスタンでのリニアレンジにサンプルを合わせる形で対応するのも手かもしれません。 マーカーについては、その挙動がいかに当てにならないか、今回思い知らされました。今後気をつけます。

(無題) 削除/引用 No.1435-12 - 2013/02/17 (日) 21:33:35 - U ポアサイズさん コメントありがとうございます。恥ずかしいのですが、結果的に私の最初の疑問はどれも的外れだったようです。Diffusion blotの結果も出たのですが、0.2microのニトロセルロース膜で行ったにもかかわらず、20ng以上ロードしたレーンでは奇麗に転写され、電圧下での転写と同等でした。1ngでは検出不能となり、これも電圧下で転写した場合と同じでした。結論として、電圧をかけて転写するかどうかが問題なのではなく、泳動あるいは転写中にrefoldingがおき、泳動自体がうまくいっていない、あるいは転写中にrefoldingしてしまって膜にのらない、といった可能性が大きいと考えられます。 タンパクのサイズにとらわれて、膜の種類やポアサイズ、使用するPAGEのタイプなどを中心に考えてしまい、元々のタンパク質の構造（Cys基など）についてよく検討しないで実験を進めてしまった事が原因でした。お恥ずかしい限りです。 マーカーの転写については依然として疑問が残りますが、目的のタンパク自体は60aaのサイズでも、十分還元されていれば、ラボで共用している0.2microのニトロセルロース膜にのる事がわかったので、dot blotで詰めていく事にしました。泳動の過程でのrefoldingがどうなっているのか不明なので、ウエスタンでの検出は一旦諦めます。ノックダウンで下がらない場合には、再度検討する必要があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1435-11 - 2013/02/17 (日) 09:25:52 - ポアサイズ このスレッドを初めに見たときに、0.2 um pore sizeのPVDF膜を使ってみたいサイズのタンバクだと思いました。翻って、0.45 um pore sizeでも2枚重ねで上手くいくという傍証が得られたという意味で、興味深い話題でした。

(無題) 削除/引用 No.1435-10 - 2013/02/14 (木) 07:30:07 - おお フィードバックありがとうございました。有用な情報になりました。

(無題) 削除/引用 No.1435-9 - 2013/02/13 (水) 02:59:04 - U 結果を報告いたします。ある程度解決したと思います。 Dot blotの結果、DTTで処理して煮沸したサンプルでのみ、強いシグナルが確認されました。1ngでも十分なシグナルが得られた事から、ウエスタンでは転写の過程で何らかの問題があったものと思われます。煮沸のみでは10ngでも非常に弱いシグナルしか見られなかった事から、 refoldingが膜への吸着の妨げになっていると思われます。PVDF膜ではロードが難しいと思われたので、0.2microのニトロセルロース膜を使ってdot blotしましたが、PVDFでなくても大丈夫なようです。この実験の本来の目的である、腫瘍組織から分離した細胞の培養上清でも、DTT処理後に煮沸したサンプルのdot plotで5ng(/2microL)相当のシグナルが見られました。今後、ノックダウンの系でこのシグナルが目的タンパクに特異的である事を確認しようと思います。 皆様、どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1435-8 - 2013/02/12 (火) 04:52:37 - U 皆様、ありがとうございます。PVDF膜のポンソーですが、マーカーの色素とかぶってしまい断定的な事はいえないのですが、一応マーカータンパクも膜にのっている感じです。ただし、サイズによる違いについては何とも言えないです。色素なしのマーカーで確認する必要があります。 中年さん ありがとうございます。リンク先、読んでみました。 これまでSDSをtransfer buffer に入れた事がなく（あまり大きなタンパクを調べる機会がなかったので）、今回もbufferには入れずにやってます。Tricine-PAGEの場合、 ゲルからもSDSは抜いた方が良いとのアドバイスを頂き、実際抜いてみたところ、泳動や低分子タンパクのゲルからのmobilizationには問題なさそう（転写後のゲルをクマシーで見た限りでは）なので、以後ゲルもSDS-freeでやってます。タンパクのロードを上げた時の問題は興味深いですが、どうも私が見ているのは逆の現象（ロードを下げた時にリニアな相関から予測されるよりもシグナルが低下してしまう）です。これは単に転写時のtransfer buffer へのロスが一定量ある事で説明できるかもしれません。 おおさん リコンビナントタンパクのdiffusion blotとdot blotを本日セットアップしました。結果を見てみたいと思います。たくさんの助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1435-7 - 2013/02/11 (月) 02:28:42 - おお >電圧で強制的に陽極側へ移動させられている状態だと、 たしかにそういうことはあるような気がします。ウエットで低電圧でオーバーナイトのほうがきれいに移るという話はありますね(通常は高分子とか、ゲルに残りやすいタンパクに対してだとはおもいますけど)。 もともとSDSPAGEと膜のトランスファーは数十kDaのタンパクをターゲットに樹立,改善されてきてますので、低分子に対して最適とはいえないんだろうとはおもいますね。電気的じゃない、キャピラリー方式でトランスファーしてみるのも確かにてかもしれません。 低分子ように、膜のメッシュ構造を最適化するといった事ももしかしたらまだできることなのかもしれませんが、研究者がこれを作るかどうかは、、、

(無題) 削除/引用 No.1435-6 - 2013/02/10 (日) 16:29:24 - 中年 以前に関連したトピックでも引用されていた、東大医科研の大海忍先生が細胞工学に昔連載されていた「ラボラトリーひとくちメモ」の記事が参考になるかもしれません。 http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo16.html

(無題) 削除/引用 No.1435-5 - 2013/02/10 (日) 15:43:46 - おお トランスファー独特の問題かどうかは、どっとブロットか、スロットブロットで比較すればわかるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1435-4 - 2013/02/10 (日) 14:06:11 - U 直輝さん 有り難うございます。ポンソーはやってないです。色素だけが抜けている可能性はまったく考えていませんでした。十分あり得る事なので、早急にチェックします。 おおさん 毎回毎回、本当に有り難うございます。まず直輝さんに指摘された点を解決してからでないと論理的に詰めるのは難しいですね。ただ、何となく自分の中にあったイメージとしては、疎水性相互作用でPVDFとタンパクが引っ付くには、ポア（ゲルではなく膜の、です）の中にいるタンパクがポアの縁のPVDFまで疎水的に引き寄せられる必要があり、そのためにはある程度の時間が必要で、電圧で強制的に陽極側へ移動させられている状態だと、特に低分子の場合その時間が取れないのでは、といった感じです。サンプル中のSDSについては、サイズの情報を得るのに必須なので、外せません（SDSを完全に抜くのならば、dot blotにします）。Diffusion blottingの論文など見ていると、少なくとも低分子タンパクの場合は、ゲルからのmobilizationに電圧は必ずしも必要ではないようで、サザンの偽物のようなセットでタンパクも転写可能みたいなので、ちょっとこの系でやってみるかどうか、検討中です。

(無題) 削除/引用 No.1435-3 - 2013/02/10 (日) 12:10:30 - おお >[Re:1] Uさんは書きました : > > （１）マーカーのサイズとすり抜けに 相関が見られないのは何故か？　PVDFのポアのサイズはタンパク１分子のサイズの１０倍あるいはそれ以上あると思われ、タンパク分子あるいはポアのサイズは膜への吸着を決定する主要なファクターではないのではないか？ マーカーは物によっては吸着しやすいようになってたりします。そのように作ったのか結果論なのか分かりませんけど、結合している色素の吸着力もかんよしてきますから。 ポアサイズは、もっと単純にかんがえて、小さいほどPVDFの濃度が高いと考えれば、化学的な平衡を考えた場合吸着により傾きますよね。 > （２） そもそもelectric fieldでtransferする理論根拠は？　もちろんゲルからのmobilization（特に高分子タンパク質）と一方向へのtransferには必要と思いますが、 疎水性相互作用によるタンパクの膜への結合にはどう影響するのか？ ゲルのポアのサイズがもっと大きければサザンブロットのように電圧をかけないでもいいです。実際タンパクをアガロースげるでながして、ササンブロットのようにトランスファーしたことがあります。巨大なコンプレックスなどを見るためです。 もちろんSDSなどがタンパクに結合しているので疎水結合に不利ですが、そのため吸着力の強い膜を採用しているのだと思います。ただこれは電気的にトランスファーする時だけではないですね。ゲルとの疎水的相互作用から逃れないとゲルに吸着してしまってトランスファーできなくなりますから。SDSが絶対必要とまでいえないですが、タンパクが電荷をもってないと、、、デタージェントを使わなくても水溶性のタンパクはいいかもしれませんけど、デタージェントで可溶化しないといけないようなタンパク質はむずかしかもしれません。 またいちどSDSなどで変成したタンパクは疎水部が外に露出したりしていますので、、、 > （３）5-10kDa（あるいはそれ以上のサイズ）のマーカーがすり抜けているのに、目的のタンパクがほとんどすり抜けないのは何故か？ 高濃度で存在した場合、転写の際ゲルから出たところで 凝集して膜にかかりやすくなる、なんて事があり得る？ 5-10kDaのマーカのホントの分子量は5-10kDaなんだろーかとかおもってしまうしだいです。そのサイズにくるだけで、もっと実際のさいずは小さかったりして、、、 > >同じような予備実験（特にマーカーのすり抜けについて）で異なる結果が得られた方がいらしたら、是非とも教えて頂ければと思います。 まああまり細かな事は検討していませんのでなんともいえませんが、ちょっとした条件のちがいでかわった結果が出てきてもおかしくないとおもいますけど。

(無題) 削除/引用 No.1435-2 - 2013/02/10 (日) 11:47:40 - 直輝 マーカーのすり抜けは、タンパクごとじゃなくて、色素だけ外れてすり抜けてるんじゃないかなぁ？ ポンソーで染めて見れば分かるかも。

ウエスタンでのタンパク質の 膜転写の 原理について 削除/引用 No.1435-1 - 2013/02/10 (日) 09:59:51 - U 低分子量（６kDa）タンパク質のウエスタンでの検出に手こずっており、リコンビナントのタンパクの希釈系列を用いた条件設定からやり直しています。Tricine-PAGE（15%、SDS free）のゲルから、セミドライ（1.5mA/cm2 const、45min、transfer bufferのMetOH 10%）で、PVDF（0.45micro）膜に２枚重ねで転写したところ、5kDaから70kDaのサイズマーカーが両方の膜に転写されました。ざっと見て１枚目に７０％、２枚目に３０％程度で、マーカーサイズによる差は見られません。100kDa以上のマーカーはあまり転写されませんが、高分子のマーカーはゲルにかなり残っており、膜への吸着よりゲルからのmobilizationが不十分な感じです。一方、immunoblotでは目的のタンパクが１枚目の膜にのみ検出され 、50-1000ngのレンジでは、大雑把に見てロードした量と相関したシグナルが見られますが、20ngあたりから急激にシグナルが低下し、1ngではどちらの膜にもシグナルが出ません。Immunoblotのリニアでの定量性に問題がある事は承知しておりますが、50ng以上と比べ20ng以下でのシグナルの低下がひどく、ロードしたタンパク量以外のファクターが関与しているのではないかと疑っています。これらの結果から生じた疑問として、 （１）マーカーのサイズとすり抜けに 相関が見られないのは何故か？　PVDFのポアのサイズはタンパク１分子のサイズの１０倍あるいはそれ以上あると思われ、タンパク分子あるいはポアのサイズは膜への吸着を決定する主要なファクターではないのではないか？ （２） そもそもelectric fieldでtransferする理論根拠は？　もちろんゲルからのmobilization（特に高分子タンパク質）と一方向へのtransferには必要と思いますが、 疎水性相互作用によるタンパクの膜への結合にはどう影響するのか？ （３）5-10kDa（あるいはそれ以上のサイズ）のマーカーがすり抜けているのに、目的のタンパクがほとんどすり抜けないのは何故か？ 高濃度で存在した場合、転写の際ゲルから出たところで 凝集して膜にかかりやすくなる、なんて事があり得る？ これまで基本原理をないがしろにして実験してきたつけを払わされている感じですが、以上３点について、ご意見伺えると幸いです。また、同じような予備実験（特にマーカーのすり抜けについて）で異なる結果が得られた方がいらしたら、是非とも教えて頂ければと思います。 長文になり申し訳ありません。よろしくお願いします。

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