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(無題) 削除/引用 No.1442-9 - 2013/02/15 (金) 14:49:27 - あい まん様 >fitcよりpe使った方が分離良くなるよ。抗原変える前にまずそれを試したらと思う ミルテニーの人もPEの方がシグナルを大きくできるとおっしゃっていました。しかし、非特異も多くなると言っていたので、今は別の抗原でやろうと思っています。 ぽ様 >想定されている目的では、蛍光標識は第1抗体でないと駄目ですか？第２抗体に蛍光標識>するとシグナルが強くなります。 アドバイスありがとうございます。 今はシグナルを強くするのではなく、MACSでの分離能を上げることを目指しております。 多くの抗原を細胞に発現させたく思っています。 123様 >FACSがあるならsortingはできないのでしょうか？ >MACSって陽性画分が30%→90％には増えますが、 >陽性率3％のものは10％ぐらいにしか増えなかったことがあります。 >その辺は大丈夫でしょうか。 FACSでsortingできればいいのですが、感染性の細胞を使用しているため、今の施設で生きたままの感染性細胞を使用できるようなFACSがありません。また陽性のものを精製してくるのではなく、陽性のものを除去し、陰性のものを採ってくるということをしたいのです。 みなさまご回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1442-8 - 2013/02/14 (木) 12:56:55 - 123 FACSがあるならsortingはできないのでしょうか？ MACSって陽性画分が30%→90％には増えますが、 陽性率3％のものは10％ぐらいにしか増えなかったことがあります。 その辺は大丈夫でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1442-7 - 2013/02/13 (水) 22:39:30 - ぽ 想定されている目的では、蛍光標識は第1抗体でないと駄目ですか？第２抗体に蛍光標識するとシグナルが強くなります。

(無題) 削除/引用 No.1442-6 - 2013/02/13 (水) 08:58:34 - まん fitcよりpe使った方が分離良くなるよ。抗原変える前にまずそれを試したらと思う

(無題) 削除/引用 No.1442-5 - 2013/02/13 (水) 08:42:14 - TK-1 いらないシグナルを入れたくないからです。

(無題) 削除/引用 No.1442-4 - 2013/02/13 (水) 08:40:51 - あい Q様 >つまり、精製が全くうまくいっていないことでしょうか？ お返事ありがとうございます。 精製が全くうまくいっていません。 ミルテニーの人にFACSのデータを送ったところ、発現量が少ないのが原因だと言われました。FITCラベルした抗体で染色し、FITCに対するビーズのついた抗体を使って精製する方法や抗体量を増やすことで改善できるかもしれないということを言われたのですが、それなら、抗原を変えた方がいいかなと思いました。 TK-1様 お返事ありがとうございます。 マウスCD90は考えたのですが、私の発現させたいタンパク質はC末端に融合タンパクをつけて発現させたいと思っています。しかしCD90はC末端にGPIアンカーがあり、融合タンパクがあると、修飾を受けないんじゃないかという心配があったので、やめました。 CD4は今候補に入っています。ここで一つお聞きしたいのですが、なぜTail-lessを用いるのですか？ダウンレギュレーションなどを防ぐためですか？

(無題) 削除/引用 No.1442-3 - 2013/02/13 (水) 00:06:39 - TK-1 抗原性という意味良く使われるのは、tail-less CD2, CD4 やGPI-anchorのCD90などです。抗体染色の感度という意味ではCD90。ほかにCD24 ヒューマンの細胞なら、mouse CD2やCD4,CD24, CD90.1どれでも手に入れば使えると思いますし、マウスならラインによってはCD90.2にしないといけない場合もあります。CD4,CD2ならhumanのcDNAをできればtail-lessで。

(無題) 削除/引用 No.1442-2 - 2013/02/13 (水) 00:02:48 - Q 何が目的か全くわかりませんが、 ＞何度か条件を変えて、MACSでCCR5陽性細胞と陰性細胞を分離してみたのですが、陽性細胞でも陰性分画にいってしまいました。 100%陰性分画に行ってしまうってことでしょうか？ つまり、精製が全くうまくいっていないことでしょうか？

表面抗原の発現について 削除/引用 No.1442-1 - 2013/02/12 (火) 23:32:28 - あい どんな分子でもいいのですが、細胞表面に何らかのタンパク質を強制発現させて、そのタンパク質を発現する細胞をMACSで分離したいと思っています。 今、CCR5を発現させたのですが、FACSとウエスタンで発現は確認できますが、発現が弱いです。 何度か条件を変えて、MACSでCCR5陽性細胞と陰性細胞を分離してみたのですが、陽性細胞でも陰性分画にいってしまいました。 そこで教えてほしいのですが、発現が容易で多くのタンパク質を発現でき、性能能いい抗体が市販されているタンパク質を知っている方がいましたら教えてください。

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