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核染色によるFACSを用いた細胞周期の解析について トピック削除
No.1454-TOPIC - 2013/02/16 (土) 13:44:29 - uk
いつも勉強させていただいております。
皆様お忙しいところ申し訳ございませんが一つご教授頂きたい事があります。
私は今、細胞周期解析を必要としているのですが、よくあるFACSを用いた細胞周期解析を方法として考えております。
下記のようなPIを用いた方法です。
http://www4.bdj.co.jp/ptProduct.jsp?prodId=21784&catyId=744882&page=product

細胞はマウスの細胞なのですが、問題として多核の細胞も多く見受けられることです。
私の研究室に細胞周期解析に詳しい人がいないので教えて頂きたいのですが、このPI等の核染色を用いたFACSによる細胞周期解析はやはり基本的に単核であることが前提なのでしょうか？
DNA含有量から細胞周期を解析するこの方法だと、多核細胞が混ざっているとヒストグラムを描いた時に結果はバラバラになってしまうのでしょうか？
基本的な事で大変申し訳ございません。
どなたか教えて頂けましたら幸いです。
　
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ありがとうございます 解決済み 削除/引用
No.1454-5 - 2013/02/19 (火) 11:01:24 - uk
U様、できるはず様

私の疑問にご丁寧にご対応頂きありがとうございます。
私もU様のご指摘の通り多核の程度が一様でない場合にはやはり原理的に解析は困難なのかなと思っておりました。
ご意見頂きすっきりしました。
他の方法での解析を検討してみます。
この度は誠にありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.1454-4 - 2013/02/17 (日) 21:55:27 - U
すいません。もう一点いい忘れました。破骨細胞のように細胞融合により多核化する細胞の場合は、log scaleでもlinear scaleでも見れないかもしれません。巨核球の場合は、細胞分化に伴いendomitosisにより2N,4N, 8N, 16N, 32N, 64Nと多倍体化していくので、log scaleで等間隔にピークが出ますが、破骨細胞の場合は、2N, 4N, 6N, 8N, 10N, 12N, 14Nといった感じで分布すると思われ、log scaleではploidyがあがるにつれピークの間隔が詰まって識別できなくなります。Linear scaleでは、4N(tetraploid)細胞のS期のど真ん中に6N(hexaploid)のG1ピークがくるので、これまた問題です。細胞のタイプ、多核化のメカニズムによって、アッセイを使い分ける必要がありそうですね。

(無題) 削除/引用
No.1454-3 - 2013/02/17 (日) 19:22:53 - U
多核あるいは多倍体化(polyploid)した細胞を含んだサンプル、例えば巨核球のように2Nから128Nまで分布しうる細胞集団だと、それぞれのピークはバラバラにはなりませんが、分布が広くなるので、log scaleで見ないと全部の細胞を一つのプロットで捉えられません。Log scaleの場合、ploidyの解析は可能ですが、S期の定量などは困難です。Linear scaleで2Nから16Nくらいまでをカバーする条件にすれば、それぞれのploidyレベルでのS期細胞の割合は見れますが、この条件でも、G2/Mと一つ上のploidyのG1がかぶってしまう（例えば、2NのG2/Mと4NのG1は同じところにピークが出ます）ので、G1やG2/Mの評価にはあまり適さないように思います。条件を変えて、16Nから64Nのピークをカバーすれば、high ploidyでのS期細胞の割合も同様に算出可能と思います。もし、サンプルに異倍体化(aneuploid)したサブクローンが含まれる場合は、仰られるようにピークがバラバラになってしまい、PI染色での細胞周期解析は極めて困難と思いますが、特殊なソフトウェアを用いた推測であれば、可能かもしれません。

もし、サンプルのploidy分布がかなり広い、あるいは異倍体化した細胞が混じっている、のであれば、他の方法（S期定量ならBrdUラベル、G2 and/or Mならヒストンリン酸化や核形態など）の方が良いかもしれません。ご参考になれば、幸いです。

(無題) 削除/引用
No.1454-2 - 2013/02/17 (日) 17:40:31 - できるはず
上のリンクが何か不明（飛べない）ですが、ふつうのエタノール固定で多核細胞の解析はできるはずです。多核でないばあい４ｎが最大ですが、８ｎところに見えたりします。

核染色によるFACSを用いた細胞周期の解析について 削除/引用
No.1454-1 - 2013/02/16 (土) 13:44:29 - uk
いつも勉強させていただいております。
皆様お忙しいところ申し訳ございませんが一つご教授頂きたい事があります。
私は今、細胞周期解析を必要としているのですが、よくあるFACSを用いた細胞周期解析を方法として考えております。
下記のようなPIを用いた方法です。
http://www4.bdj.co.jp/ptProduct.jsp?prodId=21784&catyId=744882&page=product

細胞はマウスの細胞なのですが、問題として多核の細胞も多く見受けられることです。
私の研究室に細胞周期解析に詳しい人がいないので教えて頂きたいのですが、このPI等の核染色を用いたFACSによる細胞周期解析はやはり基本的に単核であることが前提なのでしょうか？
DNA含有量から細胞周期を解析するこの方法だと、多核細胞が混ざっているとヒストグラムを描いた時に結果はバラバラになってしまうのでしょうか？
基本的な事で大変申し訳ございません。
どなたか教えて頂けましたら幸いです。
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