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(無題) 削除/引用 No.1473-5 - 2013/02/25 (月) 12:34:07 - neko おお様 お返事頂き有難うございました。 プロモーターのコンペティションについては、Western Blotなど他の方法でも確認する必要がありそうですね。また検討をさせて頂きます。 今後ともよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1473-4 - 2013/02/22 (金) 06:33:35 - おお GFPで蛍光を測るという手もなきにしもあらずでしょうけどね。プロモーターをそろえてた方が転写マシンナリーのコンペティッションがおこりにくいんじゃなかったでしたっけ、、、むかしわたしはSV40プロモーターのLacZをつかって、発現したいものにCMVをつかってましたけど。SV40のほうがあんていしてるんでしょうかねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.1473-3 - 2013/02/21 (木) 22:17:11 - neko ん様 ご返答頂き有難うございます。 回収したライセートを使ってウェスタンブロットで他に共発現させたタンパク量を調べてみましたが、それらについてはサンプル間で発現に差がないため、トランスフェクション効率がサンプル間で極端に異なるとは考えにくく、従ってRenillaのみ影響を受けていると考えました。問題のタンパクの発現量を少なくしてみて検討をさせて頂こうと思います。有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.1473-2 - 2013/02/21 (木) 13:13:00 - ん Renilla以外のコントロールに変えても、例えばアルカリフォスファターゼ、GFP, LacZでも同様のことが起こる場合、全ての発現が抑制されていると考えられると思いますので、そのタンパクの発現量を減らしていって（発現プラスミドの量を減らしていって）、コントロールが影響を受けない範囲でfire flyの誘導を見るのが良いのではないでしょうか。

ルシフェラーゼアッセイの内部コントロールについて 削除/引用 No.1473-1 - 2013/02/21 (木) 11:28:42 - neko いつも大変お世話になっております。 Dual Luciferase Reporter Assay Systemを使用し、あるタンパクのプロモーター活性を調べています。内部コントロール（Renilla活性)にはpRL-TK-Renilla Vectorを使用していますが、SV-40プロモーターで発現するあるタンパクを一緒にトランスフェクションさせると、必ずRenillaの活性がコントロールの半分からひどいときは10分の1程度まで落ちてしまい、果たしてこのRenillaがトランスフェクション効率を正しく反映しているのか非常に不安になっています。ライセートの回収時はどのサンプルも細胞数はほぼ同じであるため、このタンパクを発現させた時だけ極端にRenilla活性が落ちるのがなぜだかわかりません。トランスフェクション効率もサンプル間で10倍も違うとは考えにくく、このタンパクがRenillaの発現に影響しているのではないかと考えています。CMVプロモーターやEF-1aプロモーターのRenillaベクターも試してみましたが、やはり同様に、このタンパクを共発現させると、Renilla活性がコントロールより数倍以上低いです。このような場合、何か他に良い方法はないものでしょうか？転写因子の共発現などに影響されず、正しくトランスフェクション効率を反映する内部コントロールはないものでしょうか？ご教示のほど、よろしくお願い申し上げます。

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