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(無題) 削除/引用 No.1478-6 - 2013/02/24 (日) 17:10:27 - KEN はっきり見えなかったら、TSA増感を試してみてください。 DIGラベルRNAプローブで可能です。 うまくいくといいですね。

(無題) 削除/引用 No.1478-5 - 2013/02/24 (日) 16:06:33 - 初心者１２ Ken様，Harmonia様，AP様 早速ご回答くださり誠にありがとうございました。 その遺伝子特異的な配列が110bpしかないのでエキソン領域のプローブは１種類しか作れず，まずその部分でプローブを合成しセンス鎖をコントロールとしてin situ hybridizationを行なってみたいと思います。 3.5mM UTP，6.5mM DIG-11-UTPの組成で合成すれば，多少感度は上がるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1478-4 - 2013/02/24 (日) 10:07:02 - AP 100 bpあれば試してみる価値はあります。 標的がどのくらいリッチに発現しているかによりますが、たいていは数百ntオーダーのプローブで十分検出できます。あまり長いリボプローブは伸長しきらなかったり、断片化する必要があるので、あえて最初から100ntくらいの設計にすることもあります。極端な話、合成オリゴをプローブにすることもあるくらいですから。

(無題) 削除/引用 No.1478-3 - 2013/02/23 (土) 17:24:19 - Harmonia イントロン領域のプローブで、アクティブな転写の検出を目的に実験して いる方はいます。 イントロン部分のRNAは、スプライシングを受けたあと速やかに分解され ると想定した実験です。 エクソン領域をプローブにした実験と、観察される結果が異なることが 想像できます。 エクソン領域をプローブにした実験では、ノーザンブロッティングが 傍証になりえますが、イントロン領域をプローブにした実験では、傍証 に何を考えればいいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1478-2 - 2013/02/23 (土) 17:05:53 - KEN その遺伝子特異的な繰り返し配列等は、全くない感じでしょうか？ また、発現量によるかとは思います。 リアルタイムPCR等で、確認してみてはどうでしょうか？ というのも、単純計算で、100bpのうち、Uが25塩基。 さらに、その中でDig-UTPになるのは、6.5mM UTP，3.5mM DIG-11-UTPとかの組成で行った場合は、DIG-11-UTPは9塩基程度。 これをどれだけの感度でDetect出来るかでしょうね。 バックがあまり出なければ良いのですが。。。 私なら、増感法を併用すると思います。 PNAプローブやLNA プローブの方が、Detectは行い易いとは思いますが、外れた時が、大きすぎますからね。（笑 プローブは1箇所だけですか？ 私なら、もう5箇所くらいプローブを設計し、混ぜて使うと思います。 あと、DNAをDetectしていないことを保証するために、相補鎖のprobeはコントロールで試してみたほうが良いかと思います。

イントロンのリボプローブ 削除/引用 No.1478-1 - 2013/02/23 (土) 14:05:01 - 初心者１２ リボプローブ合成をしております。 エクソン領域は他のタンパク質とホモロジーが非常に高くプローブ配列に適さないので，同僚がイントロン領域のみからプローブ配列を選択するようにアドバイスしています。イントロンのリボプローブでmRNA前駆体を検出することはできるのでしょうか。ジゴキシゲニンを使用してマウスのin situハイブリダイゼーションをする予定です。 もしエクソンから選択すると100bpのリボプローブになるのですが，短すぎるでしょうか。 何かアドバイスを頂けますでしょうか。

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