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ポリアクリルアミドゲルから切り出したゲルについて トピック削除
No.148-TOPIC - 2012/02/11 (土) 03:43:03 - doranke
はじめまして。大学院一年の者です。

分子生物学実験で樹木木部細胞より抽出したRNAから逆転写したcDNAをもとに、DD法を行っております。

7M尿素変性4%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をした後、標的とするバンド部位のゲルを切り出し、それを鋳型としてエタ沈等の精製は介さず直接PCRを行っているのですが、その際のゲルの扱い方はどうすればよいでしょうか?


様々な実験書をあたってみましたが、統一的な見解が得られず、各々の手順の原理についても詳細な記述がなく困っております。



これまでは

切り出したゲルをエッペンドルフチューブ(1,5ml)に入れ、超純水50μlで溶かし、一晩室温で放置し、(すぐにPCRを行わなければ4℃保存)、
PCRの際にはこれを100℃で10分、ヒートブロックを用いてボイリングし、数μを採取して鋳型として使う

という手順を用いておりましたが、PCRの成功率が(特に再度同じサンプルで試行した際に)あまりよくありません。



この中で僕が具体的に疑問である点は二点で


1、切り出したゲルを保存する溶液には何を用いるとよりサンプルにとって安定なのか? 超純水orTEbuffer?

→超純水であればDNAseが失活されない点が大いに心配です。
TEbufferではPCRの際、EDTAがポリメラーゼ活性を阻害する事が予想されます。
PCRへ持ちこむのが50μ系の反応液(TaKaRaExTaq)に対して1μなのでさして影響はないとは思いますが・・・。


2、ゲルからDNAがどのように溶出されるのか?

→室温で放置する理由、ボイリングをする理由は?

室温はDNAにとっては不安定な状態だと思います。一晩という時間の理由も不明です。
ボイリングによってゲルが一時的に溶かされるのは想像がつきますが、その際、10分もの加熱でDNAが安定であると保証できるでしょうか?
また、これらの作業はDNA溶液をTEbufferにした際には超純水の時と比べて条件を変える必要はあるでしょうか?
TEのpH値が熱を加えることで変わってしまうような気がします。



先述したプロトコルは先代の先生が残してくださったものなのですが、その方と連絡をとることが叶わないため、手順一つ一つの理由を知りえない状況です。

皆さんのお力をお借りしたいです、よろしくお願いします。
 
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(無題) 削除/引用
No.148-5 - 2012/02/11 (土) 17:48:19 - AP
その程度の扱いなら、水でもTEでも大差ないと思います。
水ではDNAの安定性が劣るとしても、そう短時間で大きな差がでるわけでない。
EDTAが必要なほどDNaseがコンタミする操作ではないし、本当にDNaseがコンタミしているならTEにふくまれるEDTAくらいじゃ気休めにもならない。
PCRのときに希釈されるのでTEに含まれるくらいのEDTAで増幅が起こらなくなるくらいの阻害が起こるとは考えにくい(それより大量に投入されるdNTPのキレート効果のほうが高いのではないか?)。

それより気になるのは、尿素の持ち込みです。本当に書かれているとおりなら、かなり量の尿素(とその分解物)がPCR反応系に持ち込まれるのでは? 
エタノール沈殿などで(たいした手間じゃないでしょう)尿素を除くとか。
あるいはDNA溶出液をうんと希釈したら、鋳型量は減るにしてもかえって成功するんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.148-4 - 2012/02/11 (土) 11:23:41 - mon
質問するときに略号は使うのは良くないです。ラボスラングで一般的でない用語だったりすることもあります。DD:differencial displayですね。

Q1.DNAは室温でとても安定なポリマーです。「遺伝物質」として選ばれているくらいですから!
ただし、酸性下で切断されやすいですし、アルカリ性では1本鎖に解離しやすいです。環境から混入するDNaseに対して、EDTAは防護的に働きます。以上により、DDWより、TEの方がよいでしょう。PCRへの影響を考えるなら、EDTA濃度を0.1mMにしたTEも良いでしょう。簡便には0.1xTEでも良いでしょう。実際にはカッターやピンセット(の先端)を火炎滅菌したりDDWもオートクレーブしてあれば、ゲル中のbufferにはEDTAも入っているハズなので、さほど問題にならないと思いますけど。

Q2.DNAは拡散によってゲルから染み出してきます。もちろん長いDNAは染み出しにくいです。温めれば拡散は速くなります。アガロースゲルとは異なりアクリルアミドゲルは共有結合しているので、多少のボイルでは「溶けない」です。ただし、結合が部分的に切れたりすることはあるでしょう。(アクリルアミドゲルを自作した経験がないのかな?)
ゲルをチップで砕くか、凍結・融解でもゲルは破壊されるので、ボイルより抽出効率は良いでしょう。

またTEのpH値が熱を加えることで多少変りますが、どの程度かはご自分で確かめてみれば?
PCRのbufferって、Trisが使われていませんか?

(無題) 削除/引用
No.148-3 - 2012/02/11 (土) 10:12:59 - D&D
ゲル片を50 ulの1xPCR bufに入れて、チップの先で潰して、65℃で2時間保温して、上清をPCRテンプレートに使っています。成功率は9割以上です。いろいろな方法を試しましたが、今のところこの方法で困っていません。

Nicod JC, Largiader CR (2003) SNPs by AFLP (SBA): a rapid SNP isolation strategy for non-model organisms. Nucleic Acids Res 31: e19

(無題) 削除/引用
No.148-2 - 2012/02/11 (土) 09:56:00 - Harmonia
答えようが無い。

DD法ってなに?

泳動したのはなに?

目的語(受身形の場合は主語)が省略されていて、なにが起こっているかさっぱりわからん。

ポリアクリルアミドゲルから切り出したゲルについて 削除/引用
No.148-1 - 2012/02/11 (土) 03:43:03 - doranke
はじめまして。大学院一年の者です。

分子生物学実験で樹木木部細胞より抽出したRNAから逆転写したcDNAをもとに、DD法を行っております。

7M尿素変性4%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をした後、標的とするバンド部位のゲルを切り出し、それを鋳型としてエタ沈等の精製は介さず直接PCRを行っているのですが、その際のゲルの扱い方はどうすればよいでしょうか?


様々な実験書をあたってみましたが、統一的な見解が得られず、各々の手順の原理についても詳細な記述がなく困っております。



これまでは

切り出したゲルをエッペンドルフチューブ(1,5ml)に入れ、超純水50μlで溶かし、一晩室温で放置し、(すぐにPCRを行わなければ4℃保存)、
PCRの際にはこれを100℃で10分、ヒートブロックを用いてボイリングし、数μを採取して鋳型として使う

という手順を用いておりましたが、PCRの成功率が(特に再度同じサンプルで試行した際に)あまりよくありません。



この中で僕が具体的に疑問である点は二点で


1、切り出したゲルを保存する溶液には何を用いるとよりサンプルにとって安定なのか? 超純水orTEbuffer?

→超純水であればDNAseが失活されない点が大いに心配です。
TEbufferではPCRの際、EDTAがポリメラーゼ活性を阻害する事が予想されます。
PCRへ持ちこむのが50μ系の反応液(TaKaRaExTaq)に対して1μなのでさして影響はないとは思いますが・・・。


2、ゲルからDNAがどのように溶出されるのか?

→室温で放置する理由、ボイリングをする理由は?

室温はDNAにとっては不安定な状態だと思います。一晩という時間の理由も不明です。
ボイリングによってゲルが一時的に溶かされるのは想像がつきますが、その際、10分もの加熱でDNAが安定であると保証できるでしょうか?
また、これらの作業はDNA溶液をTEbufferにした際には超純水の時と比べて条件を変える必要はあるでしょうか?
TEのpH値が熱を加えることで変わってしまうような気がします。



先述したプロトコルは先代の先生が残してくださったものなのですが、その方と連絡をとることが叶わないため、手順一つ一つの理由を知りえない状況です。

皆さんのお力をお借りしたいです、よろしくお願いします。

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