Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る | トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

免疫沈降時のsample bufferの濃度と量 トピック削除
No.1514-TOPIC - 2013/03/06 (水) 02:52:43 - IPPPPP
最近、免疫沈降(Co-IP)に取り組み始めたものです。

手技に関して質問があります。

抗体ーアガロースビーズ複合体から蛋白を溶出する時のsample bufferの濃度と量には何か決まりがあるんでしょうか。

ネット上でいくつかのプロトコールを比較してみましたが、最後の複合体からターゲット蛋白を溶出する時のSDS bufferの濃度、量がまちまちなのが気になりました。
ひとつのプロトコールでは、蛋白lysate 100ug、抗体1ugに対してプロテインA/Gアガローズビーズ懸濁液20ul(うちビーズは25%)を加えて、最終的に40ulの1Xsample bufferを加えています。(サンタクルズ)
別のプロトコールでは、蛋白lysate 200ul、抗体2.5ugに対して、アガローズビーズ懸濁液60ul(うちビーズは50%)を加えて、最終的に50ulの2Xsample bufferを加えています。(amsbio.com)

その他、見比べてみましたが、
ビーズの量(+隙間にはいった(推定)lysis buffer量)に応じて調節しているかというと、必ずしもそうでないようでした。
sample bufferの濃度(1x,2xなど)の使い分け、またその量はどのようにして決めているのでしょうか。

よろしくお願いします。
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



4件 ( 1 〜 4 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.1514-4 - 2013/03/06 (水) 23:35:25 - IPPPPP
おおさん

コメントありがとうございます。
次回の実験ではハミルトンシリンジで洗浄時のbufferをしっかり取り除いて、通常の1XSDS bufferを使って蛋白を溶出してみます。
もし問題があれば、塩濃度含めて条件を検討してみたいと思います。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.1514-3 - 2013/03/06 (水) 03:21:01 - おお
あとは塩濃度とバッファーのもちこみかなぁ。。。SDSPAGEのバッファーけいにもよると思いますが、150mMほど塩が入ると若干解像度が鈍るようなきがしてます。

低塩濃度のバッファー(バッファーも濃度が高い必要はないとおもう)で最後に洗えば塩の影響などはさけれますね。

(無題) 削除/引用
No.1514-2 - 2013/03/06 (水) 03:10:26 - おお
ある程度のSDSがあれば抗体からサンプルが放出されます。くわえて過熱もすると思いますので、0.5%位あればOKです。ライセートにサンプルバッファーを加えるのではないので、SDS量がタンパクに対して少なすぎるということはないと思います。あとは還元剤が薄すぎてジスルフィド結合がはずせない可能性を考えたほうがでしょう。

それと感度などの問題でできるだけたくさんのせたいときと、そんなに意識しなくても十分検出できるときなどで対応が変わるかもしれませんね。

免疫沈降時のsample bufferの濃度と量 削除/引用
No.1514-1 - 2013/03/06 (水) 02:52:43 - IPPPPP
最近、免疫沈降(Co-IP)に取り組み始めたものです。

手技に関して質問があります。

抗体ーアガロースビーズ複合体から蛋白を溶出する時のsample bufferの濃度と量には何か決まりがあるんでしょうか。

ネット上でいくつかのプロトコールを比較してみましたが、最後の複合体からターゲット蛋白を溶出する時のSDS bufferの濃度、量がまちまちなのが気になりました。
ひとつのプロトコールでは、蛋白lysate 100ug、抗体1ugに対してプロテインA/Gアガローズビーズ懸濁液20ul(うちビーズは25%)を加えて、最終的に40ulの1Xsample bufferを加えています。(サンタクルズ)
別のプロトコールでは、蛋白lysate 200ul、抗体2.5ugに対して、アガローズビーズ懸濁液60ul(うちビーズは50%)を加えて、最終的に50ulの2Xsample bufferを加えています。(amsbio.com)

その他、見比べてみましたが、
ビーズの量(+隙間にはいった(推定)lysis buffer量)に応じて調節しているかというと、必ずしもそうでないようでした。
sample bufferの濃度(1x,2xなど)の使い分け、またその量はどのようにして決めているのでしょうか。

よろしくお願いします。

4件 ( 1 〜 4 )  前 | 次  1/ 1. /1


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール   アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存(次回の入力の手間を省けます)
上に上げない(トピックの一覧で一番上に移動させません)
解決(問題が解決した際にチェックしてください)
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 

〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。