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(無題) 削除/引用 No.1515-6 - 2013/03/06 (水) 23:41:16 - IPPPPP おおさん、KYさん コメントありがとうございます。 IPについてはほとんど経験がなく、アドバイス大変参考になります。 まずは文献で使われている１％TritonXで溶解、その後0.2%TritonXで洗浄、という条件を試してみます。 それでうまくいかないようでしたら、ジギトニンを購入してそちらでもテストしてみようかと思います。 膜蛋白（レセプター)とそのアダプター蛋白のco-IPは今後の課題なのですが、そちらの実験の際にはアドバイスいただいた手法を参考にしたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1515-5 - 2013/03/06 (水) 16:29:12 - おお 膜親和せいのあるものだったら、細胞をhypotonicバッファーとかで破裂させといて、核を除いたあと、30000g-100000gで膜を回収してからジギトニンを使うとそういうデタジェントでも使えると思うよ。 膜タンパクではそんなふうに膜を回収してから脂質部分を除くようなアプローチはよく取られますね。

(無題) 削除/引用 No.1515-4 - 2013/03/06 (水) 14:26:47 - KY アダプターとシグナル分子だからと言って、結合の仕方はタンパク質によると思うので、簡単にどの界面活性剤がよいとは言えません。 そもそもまずはタンパク質を抽出しないといけないので、核内のタンパク質だったら、核膜を壊せるようなＮＰ４０がいいだろうし、膜タンパク質であれば、digitoninではそもそも抽出がほとんどできないでしょうし。 まずは自分がよく使用しているバッファーもしくはdigitoninなどの弱いバッファーを試して、結合が弱いようであれば、他を試していくしかないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1515-3 - 2013/03/06 (水) 12:52:48 - おお 抗体とデタージェントの相性もありますね。NP40やTRITONX-100をWBの洗じょうで使うと可也バンドが弱くなったり検出できなくなったりすることがあります。ただIPの環境ではそんなに悪さしてないかもしれません。 deoxcholate CHAPSなどは抗体によってはIPできないあるいは結合が可也落ちるものもあるようです。

(無題) 削除/引用 No.1515-2 - 2013/03/06 (水) 08:43:42 - おお 絶対的なデタージェントのチョイスの仕方はありませんのでクリアーな回答はできませんが。。。 ジギトニンは何とか細胞膜を溶かすことができるていどかなぁというきがしています。可也弱い部類とおもっていますが、弱いというのは当てにならない場合があると思います。弱いと思ってもあるコンプレックスでは使えないとかいう話もデタージェントのチョイスではいつもつきまといますので。 tween 20、80は膜を溶かす力もそんにつよくないかんじです。 ちょっとたかいのですが、膜タンパクでよく使われるものとして、 オクチルマルトシドやグルコシド、チオグルコシドなど糖に炭素さがついたようなものがあります。膜溶解性はありますが、マイルドといわれています。 また、deoxycholateなどもよく使われていると思います。ATPsythetaseの多量体にはこれがいいようですが、かといって万能ではなくある可用性タンパクコンプレックスのコンポーネントを取ってしまうというようなことも経験しています。 ジギトニンやdeoxycholateなどステロイド骨格にニセたでタージェンといくらかあります。CHAPS、CHAPSO、BIGCHAPSなどです。 オクチルマルトシド、deoxycholateなどはミセルの分子会合数が低いので透析で抜きやすいとか、コンプレックスのサイズを見るのに懸念が少ないというりてんがあります。

アダプター分子のco-IPで使う界面活性剤 削除/引用 No.1515-1 - 2013/03/06 (水) 07:23:19 - IPPPPP よろしくお願いいます。 別トピックでIPに関して質問させてもらいましたが、co-IPに関する別の質問です。 アダプター分子とシグナリング蛋白のco-IPをしていく予定です。 文献的にみてみると、興味のあるアダプター分子をターゲットにco-IPするときは、1%TritonX lysis butterで蛋白を回収しIP複合体の洗浄は0.2%TritonX bufferでおこなうとか、別の論文では0.5%digiton lysis bufferで可溶化し0.1%digitonin bufferで洗浄をしたりしてます。 Protein-protein interactionがかなり弱いのではないかと予想されます。 一般的に、co-IP時の界面活性剤、NP-40、TritonX、digitoninなどはどう使い分けるのでしょうか。 TritonX、digitoninはNP-40よりmildという認識なのですが、それ以外にアダプターとシグナル蛋白だったらこの面活性剤がいいとか、膜蛋白とアダプターだったらこっちの界面活性剤がいいとか何か使い分けはあるのでしょうか。

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