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(無題) 削除/引用 No.1516-11 - 2013/03/11 (月) 22:51:22 - まきこ kENさん、JInさん、アドバイスありがとうございます。 imageJも簡単ではないようですね。論文で書いてあるように、熟練した病理医に判定してもらうのは難しそうなので、機械で定量化したいと考えているんですけど。まだまだ検討しなくてはいけませんね。

(無題) 削除/引用 No.1516-10 - 2013/03/09 (土) 04:36:51 - JIn 確かに、病院で診断に使っているIHCは全てFFPEなので、 実際に臨床検体を自前で解析しようとする場合に問題になるのは、 Ope室などではcolleagueの手によりいつの間にか大事な検体がホルマリン固定されてしまうことです。 こればっかりはもうルーティーンワークなのでしょうがないのですが、 固定方法によって染色性が異なる場合も考えれば、 どんなに忙しくても、切り出しから固定まですべて自分で行える環境を作るべきでしょう。 Image Jに関しては、分離度や閾値の設定を細かく変えていけば、 ある程度はうまくいくかもしれませんが、 結局は手でやるべきことを作業を簡略化しているに過ぎませんから、 どの程度信頼できるデータなのかどうかは、個々の事例によるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1516-9 - 2013/03/09 (土) 02:02:21 - KEN 細胞数のカウントに関しては、組織をImage Jでカウントするのは、経験的には、結構難しいです。 細胞境界をきっちり認識できず、3つ以上の細胞集塊を1つの細胞と認識してしまったり。。。 手で数える方が、早いと思います。 /HPF(High power field)で判定するのが良いのでは？ あと、病理の判定で一般的なのは、0, +1, +2, +3で判定する方法ですね。 ただ、何％を1、2、3とするかは、それぞれの研究によっても変わってきますけどね。。。 まずは、x50, x100, x250, x500, x1000くらいで染めてみて、至適濃度を決定してみては？

(無題) 削除/引用 No.1516-8 - 2013/03/09 (土) 01:58:03 - KEN 病院で診断に使っているIHCは、全てFFPEです。 診断に用いられている一般的な抗体であれば、特に問題はないのでは？ 賦活化は必要ですけどね。 サイトカインは、他の回答者と同様、難しいとおもいます。 ISHもFFPEでも可能です。まあ、凍結切片に比べると自家蛍光が強くなってしまうので、おすすめしませんけど、化学発色であれば、問題ないかと。 定量の方法は、面積で行う方法、Intensityで行う方法等あります。 どれが一番良いのかは、過去の論文や、一度、両方で評価してから考える必要があります。 また、メーカーがFFPEで利用可能と明記していない抗体でも論文を探せば、FFPEで実験していたりすることは多々あります。 使おうと思っている抗体をGoogle Scholar等でぐぐってみてください。(マテメソに関しては、Pubmedよりもヒットすると思います。)

(無題) 削除/引用 No.1516-7 - 2013/03/07 (木) 14:26:25 - まきこ 組織さん、いろいろ教えていただいて、ありがとうございます。 細胞数の評価方法も少し悩んでいます。 ImageJを使ってみようかなとは思っているんですが。 まずは組織を集めて染色してみるのが先決なので、染色がうまくできるようになってから悩みたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1516-6 - 2013/03/07 (木) 13:01:39 - 組織 一概にはいえませんが、可能じゃないでしょうか。 細胞数をカウントして評価する場合は、サンプルが小さい分、検体数を多くするなどの工夫ができると思います。 それかスコア化して、半定量的な評価もありかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1516-5 - 2013/03/07 (木) 12:03:49 - まきこ ありがとうございます。 mRNAはRT-PCRで評価する予定です。In situ hybridizationは、正直行ったことがないのでわかりませんが、プロトコールは私の持っている本にも書いてあるので検討してみます。 凍結切片でもサイトカインは難しいですね。勉強になりました。 もう一つ、詳しい方みえたら教えていただきたいですが、患者さんからの生検標本（パンチ生検程度）でも免疫細胞の浸潤程度の評価は可能でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1516-4 - 2013/03/06 (水) 18:19:24 - 組織 サイトカインの免疫染色は凍結切片でも難しいという印象があります。確かに抗体は色々と売られているのですが、私の経験では良い抗体に当たった試しがありません。In situ hybridizationも検討した方が良いかもしれません。 CDマーカーはパラフィン切片でも使えることがあります。

(無題) 削除/引用 No.1516-3 - 2013/03/06 (水) 17:55:53 - まきこ 素早いご指摘ありがとうございます。 そうですよね、何を染めたいかが重要ですよね。 まだ、実験を立ち上げる段階で、本当に具体的には決まっていません。 私としては、TGF-β、TNF-α、MIF、IL-17など炎症性サイトカインや、腫瘍浸潤免疫細胞（TAM、CD8+、Treg）の評価を行いたいと考えています。 パラフィンだと抗原性の低いものは染まりにくくなるんですね。それでは、サイトカインなどは評価しにくくなってしまいそうですね。 パラフィン切片で代用できるようでしたら、凍結切片をストックしておかなくてもよいかなと甘い考えをしていましたが…

(無題) 削除/引用 No.1516-2 - 2013/03/06 (水) 17:09:34 - JIn それは、ものにもよる、という回答になるでしょう。 下記を含めた過去ログを参考にされるとよいと思います。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1331

免疫染色　凍結切片とパラフィン切片 削除/引用 No.1516-1 - 2013/03/06 (水) 14:56:25 - まきこ はじめまして。 春から新たに研究を立ち上げようとしているものです。 大学院時代は、凍結切片で免疫染色を行っていました。 今度から、臨床検体（手術標本など）を用いて免疫染色を行いたいと考えています。 大学院時代にお世話になったラボの先生は、「免疫染色をするなら、絶対凍結切片でないとダメ」とおっしゃっています。 いろいろ調べてみると、パラフィン切片で行っている方も多いようですが、やはり凍結切片のほうがキレイに染まるのでしょうか？ 私としては、パラフィン切片でも同様に染色できるのであれば、そちらを採用したいと思っています。 凍結切片・パラフィン切片で免疫染色したときの違い、特性等わかる方いらっしゃいましたら、ご教授お願いします。

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