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(無題) 削除/引用 No.1529-9 - 2013/03/15 (金) 04:37:36 - おお 私の経験上のはなしは、プラスミドによって起こる、起こらないというのではなかったです。

(無題) 削除/引用 No.1529-8 - 2013/03/15 (金) 04:36:21 - おお たしかに数の問題でないかもしれませんが、未切断20ngでそのコロニー数ではちょっと低すぎませんか、、、 数がおおいからと言うのは言い過ぎですが、実際の経験じょうからきています。あるラボでコンピテントを使ったんですが、スタンダードの方法でやると(よくケミカルコンピテントかったらそれについてくるプロトコールとほぼ同様です)同じような状態になりました。 気がついていたのですが、菌数は感覚的にみても非常に多い状態でした。OD3とかそれ以上で回収しているんじゃないかと勝手に想像しています。あと、新しくコンピテントを作る時もシングルのクローンから始めないでコンピのチュウブまるごと植えていたようです(直接的には未確認です)。 まあそのコンピまくとアガロースの上になにか乗っていて盛り上がっているのが見えているじょうたいでしたので、、、、 インタクトなプラスミドはトランスフォーメーションしてごく一部しかまかないようにしてましたその場合は不思議と変なコロニーは増えないですし、全体的に菌がアガロースをカバーするような状態にはなりませんでした。 何が原因かわからないのですが、スタンダードなプロトコールで作り直すと解決しました。

(無題) 削除/引用 No.1529-7 - 2013/03/14 (木) 17:42:01 - ねこむら 回答していただいた皆さん、ありがとうございました。 ＞まんさん 失礼しました。ここでいうLawn状態は、大腸菌が通常のコロニーのように丸い形ではなく、 プレート全体にぐちゃぐちゃと生えてくる現象のことです。 ＞おおさん、cDNAさん プラスミドの量ですが、未切断のプラスミドもライゲーション溶液の方も20ng分（ベクタープラスミド換算）を形質転換に使用するようにしています。 ライゲーション溶液については、20ng分の切断プラスミドに対して、インサートDNAを加えてライゲーションしているので、切断（ライゲーション溶液）プラスミド＞未切断プラスミドになることはないと思います。pACなどの正常にコロニーが出る場合は、未切断プラスミドが2000個、ライゲーション溶液の方が200個程度です。ですから、菌数の問題ではないのかもしれません。 もしかしたら同じような症状を解決されたことがある方が現れるかもしれませんので、皆さんにご指摘頂いた箇所についてももう少し調べながら待ちたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1529-6 - 2013/03/11 (月) 08:19:42 - おお >[Re:5] cDNAさんは書きました : > おおさん、すみません、recA-なんですね。 > > でも、Ligation productの場合だけ問題があって、出来上がったplasmidではlawnにならないということは菌数の問題ではないと思いますが。出来上がったplasmidのほうが形質転換効率が悪いなんてことは考えにくいですよね。 確かに数の問題とは言い難いですけどね。インタクトのプラスミドの場合はライゲーションのときの1/10位で済ますとかいうこともあるでしょうし、、、これは本人に聞いてみないとわからないですけど。 tet+ampでセレクションするとどうなりますかねェ。。。

(無題) 削除/引用 No.1529-5 - 2013/03/10 (日) 14:22:01 - cDNA おおさん、すみません、recA-なんですね。 でも、Ligation productの場合だけ問題があって、出来上がったplasmidではlawnにならないということは菌数の問題ではないと思いますが。出来上がったplasmidのほうが形質転換効率が悪いなんてことは考えにくいですよね。

(無題) 削除/引用 No.1529-4 - 2013/03/10 (日) 13:57:22 - おお コンピテントになにか交じっているか、一回に使う菌数が多すぎるのではとおもいます。 シングルクローンを複数拾ってそれぞれから適切なOD値になるように培養してコンピを作り直して、うまく行くクローンを見つけてください。 いかはジェノタイプが載っていた文献ですが、、、必要かどうかは、、、 http://www.biomedsearch.com/attachments/00/02/52/73/2527353/nar00131-0146.pdf The E. coli K12 host strain used in these experiments, N567, has the following genotype: sup0 trpE(am)9851 laciq lacZM15 phoA20 Tn10:: recA thi.

(無題) 削除/引用 No.1529-3 - 2013/03/10 (日) 13:01:54 - cDNA N567のgenotypeに辿りつけていないのですが、C600誘導体ということなのでrecA＋のようですね。環状プラスミドでは問題がないということなので、切ったプラスミドを入れるから効率よく組換えが起こってしまってるのでしょうかね？ 詳しいこと知らずに適当なこと言ってます。形質転換の創世記に詳しい方ならご存知かもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.1529-2 - 2013/03/10 (日) 12:20:04 - まん まずlawn状態というのは何を指すのかを説明すべきかと思います。

大腸菌のLawn状態について 削除/引用 No.1529-1 - 2013/03/10 (日) 10:26:00 - ねこむら 最近、当研究室では大腸菌の形質転換の際に問題が起こっています。 現在、形質転換では主なベクタープラスミドと細胞株として、 pBRとN567、pACとDH5αを用いています。 pACとDH5αでは、通常どのような条件でもlawn状態は起こりません。 しかし、pBRとN567の場合には、次の特徴があります。 ・ベクターとインサートのライゲーション溶液を用いて形質転換を 行うとlawn状態になる。プレップ後のプラスミドで形質転換を行うと 起こらない。 ・pBRとDH5α、pACとN567の組み合わせでは起こらない。 このような状況から、N567またはpBRとN567の組み合わせに問題がありそうです。 このような特定の条件だけで起こるLawn状態はこれまで見たことがなかったので 原因がわかる方がいらっしゃいましたらご助言をお願いします。 <補足> ・プラスミドと細胞の組み合わせは形質転換効率の問題で使い分けています。 ・抗生物質などもきちんといれています。 ・pBRは耐Amp、pACは耐Cam、N567は耐Tetです。

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