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(無題) 削除/引用 No.1540-4 - 2013/03/14 (木) 00:03:31 - みゅーこ おお様 コメントありがとうございます。 確かに３０回は回し過ぎかも知れません。２０前後でのプロとコールが多いですね。減らしてやる価値はありそうですね。 unt様 同じ現象を見ていた方がいて、嬉しいです。私だけの特別なトラブルだと思ってました。 わぉ、しかもその改善策としての論文があるのですね。片方のプライマーだけで２つPCRして、あとはほぼ同じ方法のようですね。これならすぐに試せますね。 ありがとうございます。早速試してみます。

シングルプライマー 削除/引用 No.1540-3 - 2013/03/13 (水) 21:16:14 - unt はじめまして。 方法は原理は一般的なQuickChangeのまま、手元の試薬でやられているように思えます。 おおさんのおっしゃるとおり反応条件を厳しくすることで解決できそうですが 私も同様のことがあったとき、下記の方法をそのまま試してみてうまく行きました。 この方法だとリピートは原理的に形成されない、と期待できるので、条件を試行錯誤するより気が楽かもしれません。 プライマーも試薬も同じものを使えますから、試す価値はあるかと思います。 Edelheit, O., Hanukoglu, A., & Hanukoglu, I. (2009). Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology, 9(1), 61. doi:10.1186/1472-6750-9-61 増幅産物の段階でリピートが出来てしまうものなのか、あるいは変異部位周辺で高次構造が形成されていて大腸菌が解く過程でリピートが形成されるのか、などと想像していました。意図的にタンデムリピートを作れると利用価値があるかとも思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.1540-2 - 2013/03/13 (水) 20:13:19 - おお ライゲーションはしなかったのですか?それとも何かきっとの方法を使ったのですか? ちょっとどのメソッドかスッキリしませんが。。。プライマーの配列によってはプライマーダイマーのようなものが末端でプライマーとして働いたのかもしれません。30は回し過ぎのような気がしますし、条件を厳しくしてPC?Rするといいかとおもいます。

ミューテーションを入れると、プライマーが余計に入る 削除/引用 No.1540-1 - 2013/03/13 (水) 18:37:22 - みゅーこ プラスミドにミューテーションをいれております。 一般的な方法です。 変異したい塩基を中心に前後１５bpぐらいのプライマー３０merぐらいを設計し、相補鎖プライマーと一緒にPCRします。だいたいサイクルは30回ぐらいです。酵素はphusionを使用しております。 その後、DpnIで元プラスミドを切断し、アガロースゲルでPCR産物を精製し、大腸菌にトランスフェーメーションしております。 確かに変異体は作成できているのですが、８０％ぐらいは変異とさらにプライマーの領域が２−５回ぐらいタンデムにインサートされたプラスミドになってしまっております。 なぜこのようなことが起こるのか、またどうしたらプライマーのタンデムインサーションが防げるのでしょうか？ ご存知の方おりましたら、教えて下さい。

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