Bio Technical フォーラム

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iblotトランスファーを使用したDNA転写 トピック削除
No.1568-TOPIC - 2013/03/20 (水) 17:08:02 - UA
こんにちは、いつもお世話になっています。

iblotのトランスファー装置を使用したマウスのDNA転写実験を行っているのですがうまくメンブランに転写されません、アドバイスをお願いします。

手順
1.マウス（SHR）のDNAを抽出
2.EcoRTでDNAを切断、5分間65℃のヒートブロックで酵素を失活させる
3.DNAに10×Loading Buffer、1kbマーカー(TaKaRa)に6×Loading Buffer、TE trisを加える
4.厚さ4mmのSYB-G入り0.7%アガロースゲルにDNAとマーカー入れ、20分間泳動
5.ゲルをUVトランスイルミネーターで撮影


その後、ゲルのDNAをブロットするためiBlot® ゲルトランスファーシステムにiBlot® DNA トランスファースタックを使用します

6.アノードスタックをセット、ゲルを載せる
7.純水に浸したブロッティング用ろ紙を載せローラーで気泡を抜く
8.カソードストックを載せローラで気泡を抜く
9.スポンジをセットして、P3で7分トランスファー
10.メンブランをUVトランスイルミネーターで撮影


ゲルの電気泳動ではバンドが確認出来るのですが、システムを使用したメンブランへの転写はマーカーを含めまったく確認できませんでした。

どなたかアドバイスをお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.1568-7 - 2013/03/21 (木) 15:10:24 - おお
SYB-G系の色素はポジティブメンブレんではそめれる(トランスファーしてから改めてそめる)ようですが、そうでないやつではバックが高くなりすぎるとモレキュラープローブさんの製品解説に書いていました。一度ご自身でご確認ください。

(無題) 削除/引用
No.1568-6 - 2013/03/21 (木) 14:56:44 - AP
EtBrでなくてCybr-Greenでしたか。それでもおんなじことですが。

(無題) 削除/引用
No.1568-5 - 2013/03/21 (木) 14:52:13 - AP
downward capillary transferのアルカリブロットなら、通常30分くらい、余裕をみても1-2時間で完了します。エレクトロブロットまでして、さらに時間短縮する必要性を、私は理解出来ないのだが。

(無題) 削除/引用
No.1568-4 - 2013/03/21 (木) 14:47:21 - AP
>10.メンブランをUVトランスイルミネーターで撮影
ブロットしたDNAをEtBrの蛍光で見ようっての？
それは、無理だわ。エレクトロブロットでなくてキャピラリーブロットでも無理。インターカレートしたEtBrなんかは、EtBrを含まない溶液中では簡単に抜けて拡散してしまう。それにサザンするならアルカリ変成してからトランスファじゃないのかな。一本鎖に変性したらインターカレーションはほとんど起こらないですから。

十分量のDNAがブロットされていれば、UV照射したとき（撮影のためというよりクロスリンクのためですが）UVが吸収されて黒く見える（バックグラウンドのメンブレンは蛍光や散乱によって光る）のでパターンが記録できることがある。ブロットのメチレンブルー染色なら、1バンド数十ng以上あれば見える。

(無題) 削除/引用
No.1568-3 - 2013/03/21 (木) 01:17:29 - おお
転写後のあがろーすのEtBrは陰極がわに流れると思いますので、DNAがほじしているEtBrはそんなに多くないはず。EtBrはトランスファーにもあまりよくないということで敬遠されている(といいますが、サザンとかきゃピラリー方式でやるときはゲルをトランスファーのまえにぜんしょりしますので)ので膜をEtBrで検出したければ染め直さないといけないと思いますが、そう言うプロとコールは見たことがありません(やっている人もいるでしょうけど一般的ではないのだと).

膜はメチレンブルーでも染色可能かと思います。ぐぐったりしてみてください。
ゲルにのこっているDNAは確認されたでしょうか?

昔ながらのきゃピラリーで方式でトランスファーした方が確実かもしれませんよ。

(無題) 削除/引用
No.1568-2 - 2013/03/21 (木) 00:56:47 - おお
これってマニュアル通りにやられているのなら余計な心配かもしれませんけど、DNAを変性させてから転写してますよね。。。変性させないとトランスファーの効率も悪くなるんじゃなかったかなぁと、、、

iblotトランスファーを使用したDNA転写 削除/引用
No.1568-1 - 2013/03/20 (水) 17:08:02 - UA
こんにちは、いつもお世話になっています。

iblotのトランスファー装置を使用したマウスのDNA転写実験を行っているのですがうまくメンブランに転写されません、アドバイスをお願いします。

手順
1.マウス（SHR）のDNAを抽出
2.EcoRTでDNAを切断、5分間65℃のヒートブロックで酵素を失活させる
3.DNAに10×Loading Buffer、1kbマーカー(TaKaRa)に6×Loading Buffer、TE trisを加える
4.厚さ4mmのSYB-G入り0.7%アガロースゲルにDNAとマーカー入れ、20分間泳動
5.ゲルをUVトランスイルミネーターで撮影


その後、ゲルのDNAをブロットするためiBlot® ゲルトランスファーシステムにiBlot® DNA トランスファースタックを使用します

6.アノードスタックをセット、ゲルを載せる
7.純水に浸したブロッティング用ろ紙を載せローラーで気泡を抜く
8.カソードストックを載せローラで気泡を抜く
9.スポンジをセットして、P3で7分トランスファー
10.メンブランをUVトランスイルミネーターで撮影


ゲルの電気泳動ではバンドが確認出来るのですが、システムを使用したメンブランへの転写はマーカーを含めまったく確認できませんでした。

どなたかアドバイスをお願いします。
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