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(無題) 削除/引用 No.1580-9 - 2013/04/02 (火) 10:09:12 - おお p53の抗体でLacZが反応することは期待しない方がいいと思いますが、必要なら発現させたけいと、させてない系で比較するなどして反応性を見れば良いかと思います。 p53の抗体でバンドが検出されるなら基本的にp53を見ているのではないでしょうか?それで辻褄があわないかもしれないと思うなら違うp53抗体などで特異性を確認すればいいかとおもいます。 LacZがp53に対するshRNAでよくせいされないことを見るならなぜLacZを認識する抗体を使わないのですか?実験系をよく整理して考えてみてください.

(無題) 削除/引用 No.1580-8 - 2013/04/02 (火) 09:11:23 - ~ p53とLacZと表記しているのが、その遺伝子をコードする配列なのか、siRNA配列なのかを明確にすると、相手に伝わりやすくなります。 >p53の代わりにLacZを入れました。 細胞に入れたベクターは、siRNAを発現するこの２種類のベクターだけなので、LacZを発現するベクターと、そのLacZの発現を抑制するベクターの組み合わせのサンプルは無いのでしょうか。 そうであれば、使用しているLacZ(のsiRNA)のサイズは数十bpではありませんか？ 他の条件はp53(のsiRNA)と同じですよね。 ということは、LacZ(のsiRNA)を含むpHM5ベクターにより分子量53000の抗p53抗体に反応する物質が生じると考えるのは無理があるのではないでしょうか。 もしLacZと書かれているのが、LacZタンパク質をコードする全長遺伝子のことであれば、LacZタンパク質の分子量を調べましょう。 それが分子量53000前後でなければ、考え方に問題があるのでしょう。 おおさんの >それに対してどの様なコントロールをとっているのか この部分には答えられていないと思います。 そのため、 >LacZの発現抑制されるsiRNAは設計していないので、薄くならないのは結果としていいのですが の薄い濃いの比較対象が分かりません。 何かと比較して薄くならず、何かと比較して濃いのですよね。 その比較対象が何で、その比較対象のp53の発現量は何と比較してどのくらいであることが期待されるのかを明確にしましょう。

(無題) 削除/引用 No.1580-7 - 2013/04/01 (月) 18:41:35 - abc わかりにくい質問をしてしまい、すみません。 シャトルベクターpHM5にH1プロモーターを導入し、siRNAを発現させてp53を抑制する系を作製しました。そのネガティブコントロールとして、p53の代わりにLacZを入れました。 p53の発現抑制だけを見たいので、このバンドが他のバンドに比べて薄い状態ならば、求めている結果となり、実際にp53のバンドは薄くなっていました。 LacZの発現抑制されるsiRNAは設計していないので、薄くならないのは結果としていいのですが、1次抗体は抗p53抗体を反応させたので、バンドが濃いということはLacZに抗p53抗体が反応した？ということなのか、よくわからなくなってしまったので、質問させていただきました。 うまく説明できなくて申し訳ないです。

ダメージ？ 削除/引用 No.1580-6 - 2013/04/01 (月) 15:54:59 - ~ >p53の抗体が、LacZを入れたベクターの内の53000付近のタンパクに反応していると考えていいのでしょうか？ 考える前に、手持ちの資料を確認しましょう。 ベクター中に動物細胞で発現するプロモーターの下流に分子量53000付近のタンパク質がコードされていない場合、考えの前提条件が成り立ちません。 そのようなタンパク質が発現している場合、コントロール以外のサンプルにも影響が出ますので、検出系を変えたりベクターの骨格を変えたりの対応が必要です。 どちらも新規で変更するにはそれなりの費用がかかりますので、指導者に相談しましょう。 >p53の代わりにLacZを入れ、発現が抑制されていない場合は、p53よりバンドが濃いですよね？ どれとどれの比較の話でしょうか。 発現が抑制されていない場合というのはLacZのshRNAかシャッフルshRNAを入れた場合かと思いますが、"p53より"のp53がどの要件のサンプルのp53量を指しているのかが分かりません。 適切な比較対象を用意していれば、何によってバンドが濃くなるのかを導き出すことができます。 導入ベクター：p53発現ベクター、LacZ発現ベクター、ヌルベクター、ベクターなし shRNA：p53用shRNA、LacZ用shRNA、なし（、シャッフル配列shRNA） の中で、どの組み合わせのデータがあれば、 >p53の抗体が、LacZを入れたベクターの内の53000付近のタンパクに反応している と推定できるかは自分で判断できるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1580-5 - 2013/04/01 (月) 15:54:20 - おお ちょっと私が実験系を理解していないかもしれないので、あなたの実験を具体的に説明していただきませんか?なにをトランスふぇくしょんして、それに対してどの様なコントロールをとっているのかなど。 siRNAでp53を抑制している系でlacZを発現させてもエンドジーナスなp53は抑制されていてもおかしくないと思いますが、、、

p53の発現抑制 削除/引用 No.1580-4 - 2013/04/01 (月) 14:01:55 - abc 遅れましたが、お二方、回答ありがとうございます。 再び、初歩的な質問なのですが、 ウエスタンブロッティングにてp53の発現抑制を確認する際、１次抗体にはもちろんp53の抗体を用いました。このとき、p53の発現が抑制される場合はバンドが薄くなりますが、p53の代わりにLacZを入れ、発現が抑制されていない場合は、p53よりバンドが濃いですよね？これはp53の抗体が、LacZを入れたベクターの内の53000付近のタンパクに反応していると考えていいのでしょうか？ よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1580-3 - 2013/03/25 (月) 16:10:31 - ~ >なぜLacZを採用するのですか？ なぜ利用するかというと、p53用のsiRNAで抑制されないことが分かっている、細胞にあまり悪さをしない遺伝子だからでしょう。 H1 promoterでp53用のsiRNAを発現し、p53とLacZが存在しているということは、わざわざその系を作りましたよね。 その系を作った、他の遺伝子ではなくLacZをコントロールに採用した人は、ラボの中にいますよ。 >p53は遺伝子抑制を調べるときに汎用されているのですか？ p53はその機能ゆえにsiRNAの実験にもよくつかわれていますが、 所属されているラボは遺伝子抑制をテーマとしているラボなのでしょうか？ p53の機能に着目してその系を作っていませんか？ ラボのテーマと自分のテーマを理解してから実験すると、 個々の実験が何のために行っているのかが分かると思います。

(無題) 削除/引用 No.1580-2 - 2013/03/25 (月) 16:02:39 - おお LacZに対してのsiRNAはたぶんバクテリアの配列を参考にしてつくったものだと思います。ようするの対象生物にはその遺伝子がないので、理想的には何の効果もないはずです(偶然何かの配列に一致してなければ)。もし何らかの効果があるとすると、その実験系じたいがsiRNAの配列とは関係なしに起おこしていることになり、それを確かめる、その効果を差し引いた結果をだすためのコントロールと思えばいいのだと思います。同様のアイデアでGFPやLucなどの配列が使われることがあります。 ただコントロールの配列はいろいろその効果について議論があるところではありますが、詳細はあまり詳しく立ち入ったことがないです。

siRNAによるp53の抑制 削除/引用 No.1580-1 - 2013/03/25 (月) 15:08:15 - abc H1が発現するsiRNAによるp53の抑制をみるときに、対照として、p53の代わりにLacZが抑制するのか調べろ（結果としてはLacZは抑制されない方がいい）と言われたんですが、なぜLacZを採用するのですか？ また、p53は遺伝子抑制を調べるときに汎用されているのですか？ この分野について初心者中の初心者です。 よろしくお願い致します。

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