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ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.1588-10 - 2013/04/07 (日) 12:55:47 - 初心者 TBSでホルマリンを希釈してホルマリン固定すると、抗体染色はできます (2次抗体はAlexa)。Alexa Fluor ファロイジンのみ染色できません。 >[Re:9] monさんは書きました : > 培養細胞なら、PBS+ホルマリンで十分だと思います。 > もっとも、細胞がいる培地に直接ホルマリンを1/10量添加するプロトコールも見たことがありますので、Tris濃度によっては問題ないかもしれません。 > と、思い計算してみると... > 10%ホルマリン=3.5%ホルムアルデヒドとすると、0.93M（密度0.8, MW=30)なので、大過剰ですね。これならTBSでも固定はできそうだ。あれ？？ > pHが狂うのが原因か、架橋されたTrisが染色性を下げるのかな？ > 明確な根拠がなくて申し訳ないです。

(無題) 削除/引用 No.1588-9 - 2013/04/02 (火) 19:16:38 - mon >[Re:8] 初心者さんは書きました : > TBSでホルマリンを希釈していました。ホルマリン固定時のみPBSにするのがよいでしょうか？ そうです。PBSではなく、より緩衝能が強く等張液でもある0.1M Na-PO4(pH7~8)を使うこともあります。培養細胞なら、PBS+ホルマリンで十分だと思います。 もっとも、細胞がいる培地に直接ホルマリンを1/10量添加するプロトコールも見たことがありますので、Tris濃度によっては問題ないかもしれません。 と、思い計算してみると... 10%ホルマリン=3.5%ホルムアルデヒドとすると、0.93M（密度0.8, MW=30)なので、大過剰ですね。これならTBSでも固定はできそうだ。あれ？？ pHが狂うのが原因か、架橋されたTrisが染色性を下げるのかな？ 明確な根拠がなくて申し訳ないです。

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.1588-8 - 2013/03/31 (日) 10:27:04 - 初心者 TBSでホルマリンを希釈していました。ホルマリン固定時のみPBSにするのがよいでしょうか？ >[Re:7] monさんは書きました : > もしかして、ホルマリン固定の時にTBSを使っていませんか。 > Trisのアミノ基がホルマリンと反応して、固定が不十分になる可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.1588-7 - 2013/03/27 (水) 17:41:17 - mon もしかして、ホルマリン固定の時にTBSを使っていませんか。 Trisのアミノ基がホルマリンと反応して、固定が不十分になる可能性があります。

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.1588-6 - 2013/03/27 (水) 17:39:48 - 初心者 ポジティブコントロールで同時にPBSで染色すると染まりますので、固定法は同じです。 >[Re:2] TSさんは書きました : > 他に何か変えていませんか?　固定法とか。 > あるいはお使いのTBSが何かおかしいとか。 > > 同時にPBSで染めると染まるのですよね?

(無題) 削除/引用 No.1588-2 - 2013/03/27 (水) 16:05:36 - TS 厳密に同じことをしたわけではありませんが、 Rhodamine-phalloidinでは、PBSでもTBS-Tでも染まります。 たぶん、AlexaもTBSも問題ではないように思うのです。 他に何か変えていませんか?　固定法とか。 あるいはお使いのTBSが何かおかしいとか。 同時にPBSで染めると染まるのですよね?

Alexa Fluor ファロイジンによるF-アクチンの染色 削除/引用 No.1588-1 - 2013/03/27 (水) 12:55:55 - 初心者 細胞のF-アクチンをAlexa Fluor ファロイジンで染色しています。PBSで染色するとよく染まっていたのですが、バッファーをTBSに代えたら全然染まらなくなってしまいました。どなたか原因をご存知でしょうか？

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