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(無題) 削除/引用 No.1594-5 - 2013/04/02 (火) 11:08:15 - ねこ pan様 ご教示頂き有難うございます。 なるほど、同じIgGでもアイソタイプによってバンドも異なってしまうのですね。大変勉強になりました。モノクロの方はマウスIgG2aKなので、同じタイプのコントロールを探してみます。有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.1594-4 - 2013/04/02 (火) 11:03:06 - pan ポリクローナル抗体は様々なアイソタイプの抗体が混ざっていますから、 H鎖、L鎖ともに大きさが少しずつ異なるものが混ざっています。WBをするとモノクロより幅広のバンドとして検出されてしまいますし、非特異のバンドも出やすいです。そういったことを防ぐには、ネガコンも モノクロを使った方が良いです。MBLとかでモノクロの各アイソタイプ抗体が 売られていたと思いますよ。または2次抗体で変性したIgGを認識しないものを使う(True blot)とかしたらどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1594-3 - 2013/04/02 (火) 10:08:06 - ねこ モモ様 お返事いただき有難うございます。 やはり実際のバンドを見て抗体量をそろえるというのが一番現実的なようですね。ラベルに記載のある濃度から計算してそろえたつもりだったのですが、実際のHeavy Chainのバンドの大きさが全く異なっていたので驚いていました。

(無題) 削除/引用 No.1594-2 - 2013/04/01 (月) 20:23:37 - モモ バンドの濃さが違うのは恐らく抗体の量が違うからでしょう。 バンドの濃さがそろうように使えばいいんじゃないですか？

IP時に使用するコントロールIgGについて 削除/引用 No.1594-1 - 2013/03/30 (土) 07:01:28 - ねこ いつも大変お世話になっております。 IPでEndogenousのタンパクの結合を見ております。タンパク（A)をIPする抗体が、マウスIgG2モノクロナール抗体なので、コントロールとして、等量（5ug)のnormal mouse IgG (poryclonal)を使用しています。ところが、タンパク（B)抗体（マウス）を用いたWestern Blotをした際、コントロールIgG重鎖のバンドがIP抗体（A)のIgG重鎖バンドよりも2倍以上大きく、コントロールなのにその他の部位にも非特異なバンドが多く見られます。NormalIgGのレーンの方がIgGが濃くなっているようです。そのため、IP抗体（A）を用いたレーンに見られるバンドが本当にタンパク（B）なのかどうか自信が持てず、困っています。IP抗体と等量のNormalIgGを使っているのに、なぜIgG重鎖バンドの大きさが明らかに異なるのでしょうか？この場合、どのように対処したらよいでしょうか（勝手にNormalIgGの量を減らしてもよいものかどうか）？Lysateは細胞から0.1%NP40とSonicationで抽出し、タンパク量約1.8�rのLysateをProteinAで30分Precleanの後、IP抗体（またはNormalIgG)で2時間、その後ProteinAを30ul加えて1時間インキュベートしています。抗体はタンパク量1.8mgに対して毎回5ug使用しています。ご教示のほどよろしくお願い申し上げます。

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