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(無題) 削除/引用 No.1598-10 - 2013/04/03 (水) 00:05:02 - おお >[Re:6] ゆうさんは書きました : > > 一応プラスミドのプロモーター内にSD配列様の部分があるので > たぶんこのあたりから読まれているのかな…という程度ですが予測は立っています。 あ、これならスプライシングにこだわらなくても、SD以降に1か2塩基挿入、または削ればいいような気もしてきた。

(無題) 削除/引用 No.1598-9 - 2013/04/02 (火) 16:32:44 - ゆう ＞おお さん なるほど、5'-UTRに入れるという方法もあるのですね。 というより、この業界(?)ではそちらの方が一般的なのでしょうか。 発現タンパクのペプチド配列に影響が無いので良さそうです。 検討させていただきます。 ＞中年 さん すみません、あまり詳しく書くと研究室を特定されかねないかなと思って書かなかったのですが、 実は糸状菌への導入にアグロバクテリウムによる感染法を用いておりまして、 大腸菌内だけでなくアグロ内での毒性も問題になっているのです。 (ここまで書いて気付いたのですが、アグロはグラム陰性菌なので ＳＤ様配列とは関係ない位置から転写されている可能性がありますね…) ですので、イントロンを利用する方法なら両方クリアできるかなと考えた次第です。 せっかくアドバイスいただいたのに申し訳ありません。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1598-8 - 2013/04/02 (火) 15:27:46 - 中年 大腸菌に対する毒性がどれくらいかにもよりますが、プラスミドのコピー数を落とすことで問題をクリアできないでしょうか。pUC由来のベクターなら、大腸菌の形質転換以降の培養を全て30℃以下で行えばコピー数はかなり下がります。私たちもこうしないと安定して増やすことのできない気難しいプラスミドをいくつか扱っています。これで不十分であれば、さらにコピー数の少ないpACYC系のベクターを使うこともあります。

(無題) 削除/引用 No.1598-7 - 2013/04/02 (火) 11:23:30 - おお >[Re:6] ゆうさんは書きました : > ＞おお さん > > 一応プラスミドのプロモーター内にSD配列様の部分があるので > たぶんこのあたりから読まれているのかな…という程度ですが予測は立っています。 それが悪さしているのなら5'UTRに入れればいいでしょうね。イントロンの長さが3の倍数になってないとか、どう転んでもイントロン内でストップが入るようにすればいいかと。5'UTRの翻訳開始を邪魔しないように(配列をいじって壊さないように)少し余裕をみて少し上流の方にいれればいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1598-6 - 2013/04/02 (火) 11:13:04 - ゆう ＞おお さん 詳しい情報ありがとうございます。 やはりエキソンの情報も重要なのですね。 できるだけ余計な塩基は残したくないのですが… 元の遺伝子と全く同じ配列になるような部分もなかなか無さそうですし ＫＹさんの挙げて下さったベクターを参考にすると ＯＲＦの頭に数塩基のエキソンごと入れてしまうのが現実的でしょうか。 イントロンに関しては全長150〜200bpくらいのものをいくつか試してみるつもりで、 今のところ短くしたり配列をいじったりということは考えていないので 長さやイントロン内モチーフについては大丈夫かな？と思います。 一応プラスミドのプロモーター内にSD配列様の部分があるので たぶんこのあたりから読まれているのかな…という程度ですが予測は立っています。 文献についても複数挙げていただき、ありがとうございます。 読ませていただきます。 ＞ＫＹ さん 具体的なベクターの例をありがとうございます。 ＯＲＦの頭にイントロンを入れてしまえば良いのですね。 今回私が使っている外来遺伝子を植物に導入する際の論文では ＯＲＦのど真ん中に入れていたので、 ｢真ん中に入れなくちゃ｣と思い込んでいました…。 まだまだ手探り状態でうまくいくかはわかりませんが、 いただいた情報を参考に試してみたいと思います。 お二方とも、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1598-5 - 2013/04/02 (火) 03:11:51 - おお ttp://www.cbs.dtu.dk/services/NetAspGene/ ttp://www.broadinstitute.org/annotation/genome/aspergillus_group/GeneFinding.html#q9 ttp://genome.cshlp.org/content/18/12/1979.long ttp://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1087184508002004 まあそれなりに論文はあるようですが、、、 あとyeastのスプライシングに関してのレビューなどで重要な配列がある位置など確認されるといいかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1598-4 - 2013/04/02 (火) 02:13:12 - KY ほ乳類発現用のCAGプロモーターにはb-globinのイントロンが入っております。その下流にAtgからcDNAを入れるだけで発現できるようになってます。 参考にどうぞ。 cre酵素が入ったベクターマップですが、 http://www.addgene.org/13775/ ちなみにCAGプロモーターを作成したのは日本人の先生です。 ただこのイントロンの目的はmRNAが核外に出やすくするとか他の目的かもしれません。適当な記憶です。 糸状菌のことはわかりりませんが、普通に考えるとその糸状菌のベクターの転写開始点の後ろにb-globinのイントロン配列を入れて、その後に目的のcDNAをAtgから入れればいいと感じます。

(無題) 削除/引用 No.1598-3 - 2013/04/02 (火) 01:21:01 - おお プロモーターとイントロンの関係は選択的スプライシングが起こらないような場合は無視してもいいかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.1598-2 - 2013/04/02 (火) 01:18:01 - おお まずはその系でうまく働くようにするためには、どこから大腸菌で読まれているかなど情報がないといけませんけど、、、sdからの予測とかできなくはないでしょうけど、、、 まあその辺はクリアーしているとして、イントロンのながさは短すぎないほうがいいとおもいます。わたしは哺乳動物がおもなのでちょっとよくわかりませんが、100以下になると(実際はもう少し小さいばあい)うまくスプライシングされません(れいがいがありますが)。 スプライシングされるサイトの周辺が最も重要でその場所からエクソン側6ベースぐらい、アクセプター側の上流イントロン10-20ベースのモチーフがあります(逆にいえばそこさえ保存されていればイントロンの長さを短くしたりすることも可能です)。モチーフはそんなに保存されてない場合もありますが、そう言う場合はエクソン上にあるほかの配列などが必要になってきたりします。 一番確実性があるのは、そう言うゲノムにある配列を使うことですが、エクソン側の制約もありますので、ORFに挿入するには場所を選ぶかもしれません。 糸状菌に関してはわかりませんが、酵母などスプライシングされる配列のマトリクスが出来上がっていますので、塩基配列をいじった場合スプライシングされるかどうか予測はかのうです。 インとろんの境界のGU-AGは必須です。

人工的にイントロンを挿入する際の考慮点 削除/引用 No.1598-1 - 2013/04/01 (月) 22:06:57 - ゆう 糸状菌で、とある外来遺伝子を発現させようとしています。 そのためのプラスミド作製を大腸菌で行なっているのですが、 プラスミド内に大腸菌のプロモーター様の配列があるようで、 大腸菌内でタンパクが発現してしまって毒性を示すためにプラスミドが増やせない という問題にぶつかっています。 このような場合、植物やヒト用プラスミドでは 目的遺伝子内に人工的にイントロンを入れて大腸菌内で発現しないようにする という手法があると知り、 同じ事が今回の糸状菌でもできないか？と考えました。 しかし私の研究室にはイントロンを利用してどうの…ということをしたことのある人がおらず、 イントロンを挿入すると言ってもどこにどう挿入すればうまくスプライシングされるのか見当もつかず 途方に暮れている状態です。 文献を探してみましたが、そこまで基本的な事に言及しているような文献を見つけることができませんでした。 （これは私の探し方が悪いのだろうと思いますが…） そこで質問です。 1)糸状菌由来の遺伝子のイントロンをまるごと目的の外来遺伝子に挿入するつもりなのですが、 　イントロンを挿入する位置や、イントロン前後の配列は 　元の遺伝子内のものにできるだけ近くするべきでしょうか？ 　その場合、どのくらい近づければよいのでしょうか。 　(イントロン前後の配列だと何塩基くらいは同じにするべき、など) 2)用いるプロモーターも、イントロンと同じ遺伝子由来のものを使った方が良いでしょうか？ 　(植物などでは特に揃えてはいないようですが…) 3)糸状菌でこのような試みを行なっている文献などあればお教え下さい 4)糸状菌に限らず、イントロンを別の遺伝子に挿入する際の条件を 　検討したような文献があればお教え下さい 色々と挙げさせていただきましたが、つまるところ疑問点は ｢イントロンの何が認識されてスプライシングされるのか？｣ということに尽きます。 イントロン配列に全てのシグナルが含まれているのであれば どこに挿入してもスプライシングされることになるのですが、 そういうものなのだろうか…と。 ご教示いただければと思います。

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