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(無題) 削除/引用 No.1604-10 - 2013/04/03 (水) 18:41:02 - 美しい大腸菌 ありがとうございます！ TOYOBOを検討してみます。 あと、タカラでもBACを導入できるようなコンピテントセルも 売ってるそうなので、そちらも検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.1604-9 - 2013/04/03 (水) 18:19:51 - 7744 20kbぐらいまでDH5aに入れています。 もちろん既にできているプラスミドではなく、ライゲーション反応を行ったものを。 21と20でそんなに変わるとは思えないけど・・・。 toyoboのDH5a 参考まで。

(無題) 削除/引用 No.1604-8 - 2013/04/03 (水) 14:39:04 - AP >TOP10とDH10ｂはほぼ同じと聞いたことがありますが、遺伝子型の表記は違いますね。 両者はどちらもMC1061の派生系統で、closely relatedだそうな。 http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#TOP10_.28Invitrogen.29 遺伝子型の違いってrpsL (streptomycin resistant)だけかしら。

(無題) 削除/引用 No.1604-7 - 2013/04/03 (水) 14:19:00 - AP 本当に製品が切り替わったせいでしょうか？　製品が切り替わった時期と、コンストラクトがうまくいっていないのがタイミング的に合っただけとか。 以前、上手くコンストラクトができたプラスミドを使って、コンピーテンシーが不十分なのかどうか、確認してしては。 常識的に言って、エレクトロポレーションで20 kbくらいのプラスミドなら、JM109とかXL1-Blueとか、とくに大きいサイズのプラスミドを取り込みやすいのではない系統でも、十分に実用にたえます。また、Inoue法のような高コンピーテンシーを得られるケミカル法でも、20 kbくらい射程距離です。

(無題) 削除/引用 No.1604-6 - 2013/04/03 (水) 14:01:38 - aji TOP10とDH10ｂはほぼ同じと聞いたことがありますが、遺伝子型の表記は違いますね。TOP10、私の周囲では評判良いです。 ただ、エレポ用のコンピなら作るのはかなり簡単なので、実績のあるDH10ｂで自作をお勧めします。それにケミカルコンピでも作っているラボは沢山ありますので、決して難しくはありません。

(無題) 削除/引用 No.1604-5 - 2013/04/03 (水) 12:49:40 - 美しい大腸菌 実はXL10 goldも試したのですが、コロニーが取れませんでした…。 テクニカルの問題の可能性は除外できませんけど。

(無題) 削除/引用 No.1604-4 - 2013/04/03 (水) 12:31:28 - おお いや、ライゲーションプロダクトならそれでもおかしくはないと思います。 XL10 goldで大きいやつでうまくいったことがあります。20kb以上ではないですがまあそれに近いやつでした。わたしはケミカルコンピテントでしたけど。

(無題) 削除/引用 No.1604-3 - 2013/04/03 (水) 11:52:01 - 美しい大腸菌 50ngのベクター(14Kb)にインサート(7Kb)にライゲーションしました。 ベクター : インサート = 1:3のモル比で。 その後、フェノクロ、エタチン(-20℃、O/N)して、DNAペレットを 5ulのTEで溶かしてDH10bにエレポしました。 これでコロニー100個は少ないのですかね？ いつもこの方法でやってましたが、問題なくベクターは作れてました。

(無題) 削除/引用 No.1604-2 - 2013/04/03 (水) 11:34:31 - おお 100個ってどれくらいのDNAをつかったのか分かりませんけど、少なくないですか?まずはテクニカルに問題がないか気になるところですけど、、、

長鎖ベクターを効率良く導入できるコンピテントセル 削除/引用 No.1604-1 - 2013/04/03 (水) 09:37:28 - 美しい大腸菌 20Kb以上のベクターを構築しています。 20Kb以上でも効率良く導入できるコンピテントセルでお勧めはありませんか？ 以前は、インビト○ジェン社のE-shot DH10bにエレポしてコンピテントセルに 導入していましたが、安定して100個ほどのコロニーが得られてました。 しかし、この製品が生産中止になり、代替品のMegax DH10bでエレポしても 全くコロニーが得られなくなりました…。

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