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(無題) 削除/引用 No.1605-11 - 2013/04/11 (木) 04:26:43 - よし Atail様、qq様、おお様 お返事いただき有難うございました。 ご教示の通り、核内での検討をしてみようと思います。分画化に使用するバッファーについては文献等を探してみます。 今後ともよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1605-10 - 2013/04/11 (木) 00:49:53 - おお 核を取ってきてそこからライセートを得るのは私もやる価値があると思います。最初に書こうかと思っていましたけど、ややこしくなりそうだったので、、、 核ないのタンパクって意外とIPとか難しいものがまあまああります。架橋剤、コンプレックス解析、Y2Hなど幅広い方法を念頭に入れた方がスッキリするかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1605-9 - 2013/04/10 (水) 21:43:30 - qq ChIPの条件などを参考にするのも良いかもしれません。 真ん中でSSで繋がっているような架橋試薬なども、検討の価値がありそうです。 わたしは普通のIPしかやったことがありませんのであしからず。

(無題) 削除/引用 No.1605-8 - 2013/04/10 (水) 10:03:33 - Atail 私も核抽出液からのIPに一票です。お使いの生物種が分かりませんが高等真核細胞でしょうか。細胞分画後の粗核画分ペレットを現在お使いのIPバッファで懸濁すればIPに使えるとは思います。その上で、見たい相互作用がsonication resistantかどうか（needlingで調製したlysateと比較する等）を検討されてみては如何でしょうか。参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1605-7 - 2013/04/07 (日) 09:22:08 - よし qq様 有難うございます。おっしゃる通りで細胞内での結合を証明する必要があります。一方のタンパク質は核内中心に存在し、もう一方は核内、細胞質内両方に存在します。Transfectionで強発現をさせた際には、1%NP-40のバッファー（他Tris-HClとNaClです）。で結合が証明できています（NP-40なので、細胞質内のタンパクを中心のLysateと考えてよろしいでしょうか？）。しかし内因性のタンパクでは、0.1%NP-40バッファー（他Tris-HCl、NaCl、EDTA、グリセロール）にSonicationを加えて、一応細胞質内、核内の両方の成分が入るようなイメージでやっています。細胞質内、核内別々のIPが理想ですが、核内成分を抽出する際に、抽出液の組成成分（Detargent)などで結合が壊れてしまう事を懸念しています。もし核内のタンパク結合を見るためのIP等ご経験がございましたら、IPのための核内成分抽出に適した抽出法をご教示頂けましたら大変うれしいです。よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1605-6 - 2013/04/07 (日) 08:55:17 - qq 細胞内で結合していることを想定しているのであれば、核抽出液と細胞質抽出液は、別々にIPすべきじゃない？ vitroでbindableを見るだけなら、recombinantを二つ作ってプルダウンアッセイでよいでしょうが、それではあなたの目的に叶わないのでしょ？

(無題) 削除/引用 No.1605-5 - 2013/04/07 (日) 02:50:20 - よし KY様 アドバイス頂き有難うございます。 そうですね、おっしゃる通り、まずは条件の適正化から始めようと思います。 今度ともよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1605-4 - 2013/04/04 (木) 13:29:53 - KY >タンパクの発現量自体は極めて少ないです。特に核内にある方は、このやり方でとったTotal Cell Lysateを60ug使用し、Western Blotを行い、最終的にはFemtoを使ってようやく検出しています。 発現量が少ないことを気にしているようですが、それは発現量が少ないのではなくて、その抗体の検出能力が弱いだけではないのでしょうか？そうであれば、発現が少ないから結合がすぐに見えなくなってしまうような心配は無用だと思います。 良い抗体を手に入れる事が一番の解決策ですが、他に抗体がない場合はどうしようもない。 まずは過剰発現で条件を決めてから、内在性のIPをした方がよいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1605-3 - 2013/04/04 (木) 12:29:53 - よし おお様 お返事いただき有難うございました。 対象とするタンパクによるとのこと、了解いたしました。 まずは自分なりに試行錯誤をしてみる所存です。 また困ったら投稿をさせて頂きます。よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1605-2 - 2013/04/04 (木) 11:48:33 - おお デタージェントにしてもソニケーションにしても条件をふってやってみないとここのタンパクで違うので絶対にこれということはいえません。 ソニケーションがタンパクへんせいを促すのは確かですが、すべてのタンパクがいっせいに変性するわけではありません。ソニケーションしてしっかりと抽出できて機能を保っているタンパクもあります。 デタージェントも1%のTRITONやNPー40にさらに0.5% deoxycholate加えた状態でコンプレックスIPしているものもあります。 まあとりあえず、どんな抽出条件で抽出されたのか、IPできたのか書いてくれればアドバイスしやすいとおもいます。 デタージェントをつかわないnuclear extractのとり方も一般的なほうほうがありますので、どうしてもという時はそれもやってみるといいかもしれません。

IPでSonicationの適応についてお教え下さい 削除/引用 No.1605-1 - 2013/04/04 (木) 10:15:24 - よし いつも大変お世話になっております。 IPで内因性タンパクの相互作用を見ようと思っていますが、なかなかうまくいきません。細胞質と核内両方に存在するタンパクと、核内に主に存在するタンパクの相互作用なので、50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 250 mM NaCl, 0.1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glycerolのバッファーで細胞融解後に、10秒ほどSonicationをしています（メモリは10段階の8程度）。核内のタンパクも抽出したいのですが、あまり強烈なバッファーを使うと相互作用自体が壊れてしまうのを懸念し、0.1%NP-40にSonicationという組み合わせにしたのですが、Sonication自体も相互作用を壊してしまうことがあるため、さじ加減をどのようにしたらよいか迷っています。タンパクの発現量自体は極めて少ないです。特に核内にある方は、このやり方でとったTotal Cell Lysateを60ug使用し、Western Blotを行い、最終的にはFemtoを使ってようやく検出しています。そもそもその程度しか発現していないタンパクの相互作用を見ること自体が困難なのでしょうか？このケースでSonicationを行うのは正しいでしょうか？また、極微量タンパク質同志のIPの際に、最大でどれくらいの大きさのプレートにまいた細胞をどのような種類のどれくらいの量のバッファーで回収して、そのLysateすべてを使って、どれくらいの量のIP抗体を使用されているのか、もしご経験のある方がいらっしゃいましたら、試すことのできる最大限のIPの方法をお教え下さい。よろしくお願い申し上げます。

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